westernblot原理和技术上课
35页1、n为什么要作蛋白质印迹实验? q研究一些体外的蛋白质分子,寻找目的蛋白是否存 在样品当中 q蛋白质的表达情况,上调或下调表达,在不同的样 品中,如疾病和正常的样品之间的表达差异性。 定义: n印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测 反应来检测样品的一种方法。 n1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利 用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。 n而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹 分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Towbin, H., et al. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Aca
2、d. Sci. USA 76, 4350-4354. Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从 凝胶转移至一种固相支持体,然后用 这种多肽的特异抗体来检测。 基本流程 BCA法蛋白浓度定量基本原理 nBCA(2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠,bicinchoninic acid) n在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成 Cu1+(biuret reaction)。BCA与Cu1+结合形成稳 定的紫蓝色复合物,在562 nM处有高的光吸收值并 与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。 q不连续的电泳缓冲体系。 qSDS蛋白质复合物在凝胶电泳时,不再受 蛋白质电荷与形状的影响,而只取决于蛋白 质分子量的大小。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶成分 M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰 胺 MSDS(十二烷基磺酸钠) M配胶的Tris缓冲液 MTEMED(四甲基乙二胺,加速剂加速剂) MAPS(过硫酸铵,催化剂催化剂) MTris-甘氨酸电泳缓冲液 SDS: n阴离子去污剂 变性剂 n氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶 束。 n蛋白
3、质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有 的电荷量,消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 n与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开,使蛋白质 分子线性化。 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide, 简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网 状结构的凝胶。化学惰性强,具有一定的机械强度和透明 度。是良好的电泳介质。 凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度()线性分离范围(KD) 1512-43 1016-68 7.536-94 5.057-212 SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方 表: 灌制分离胶 隔绝空气 灌制积层胶 插入梳子 蛋白样品的变性蛋白样品的变性 n2SDS-PAGE上样缓冲液: nDTT可临用前以1:4比例混合加入,亦可全部配好分装,-20冻存。 n按1:1比例与蛋白质样品混合,95100加 热515min
4、,冰上冷却后再上样,上样量 一般为20-25l,总蛋白量2050g。 1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml 1M DTT20 ml SDS4 g 甘油20 ml 溴酚蓝0.2 g 总体积100ml Staking gel Separating gel 不连续电泳: 作用缓冲液PH凝胶浓度 浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris- Cl 低,2-5% 分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris- Cl 高,根据蛋 白大小 电泳缓冲液:pH8.3 Tris-甘氨酸系统。 转膜 n要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载 体(例如NC膜)上,通常有两种方法:毛细管 印迹法和电泳印迹法。 n常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原 理完全相同,只是用于固定胶/膜叠层和施加电 场的机械装置不同。 转移膜的选择转移膜的选择 n最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维 素(Nitrocellulose,NC)膜和聚偏二氟乙烯 ( Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜,此外也有 用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜 和NC膜的特点相似,主要用于
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