westernblot原理和技术上课

n为什么要作蛋白质印迹实验？ q研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存 在样品当中 q蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样 品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。 定义： n印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测 反应来检测样品的一种方法。 n1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利 用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 n而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹 分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Towbin, H., et al. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354. Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从 凝胶转移至一种固相支持体，然后用 这种多肽的特异抗体来检测。 基本流程 BCA法蛋白浓度定量基本原理 nBCA(2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠，bicinchoninic acid) n在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成 Cu1+（biuret reaction）。BCA与Cu1+结合形成稳 定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并 与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 q不连续的电泳缓冲体系。 qSDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受 蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白 质分子量的大小。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶成分 M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰 胺 MSDS（十二烷基磺酸钠） M配胶的Tris缓冲液 MTEMED（四甲基乙二胺，加速剂加速剂） MAPS（过硫酸铵，催化剂催化剂） MTris-甘氨酸电泳缓冲液 SDS： n阴离子去污剂 变性剂 n氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶 束。 n蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有 的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 n与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质 分子线性化。 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide， 简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网 状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明 度。是良好的电泳介质。 凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（）线性分离范围（KD) 1512-43 1016-68 7.536-94 5.057-212 SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方 表： 灌制分离胶 隔绝空气 灌制积层胶 插入梳子 蛋白样品的变性蛋白样品的变性 n2SDS-PAGE上样缓冲液： nDTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。 n按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加 热515min，冰上冷却后再上样，上样量 一般为20-25l，总蛋白量2050g。 1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml 1M DTT20 ml SDS4 g 甘油20 ml 溴酚蓝0.2 g 总体积100ml Staking gel Separating gel 不连续电泳： 作用缓冲液PH凝胶浓度 浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris- Cl 低，2-5% 分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris- Cl 高，根据蛋 白大小 电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。 转膜 n要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载 体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管 印迹法和电泳印迹法。 n常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原 理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电 场的机械装置不同。 转移膜的选择转移膜的选择 n最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维 素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （ Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有 用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜 和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 n各种膜的详细特点介绍： n 湿转系统 半干转移系统 丽春红染色丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离 子水漂洗PVDF膜，换水2次。 考马斯亮蓝染色（染胶） 转膜后检测（此步可以省略转膜后检测（此步可以省略 ） 封闭封闭 S S 为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜 发生非特异性结合，使非特异性背景提高，发生非特异性结合，使非特异性背景提高， 需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 S S 5%5%脱脂奶粉或脱脂奶粉或BSABSA（室温孵育（室温孵育1h1h） S S Western Blot Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）膜封闭液（生物试剂公司） S S Tween-20Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影的作用：减少非特异性吸附，不影 响抗体与抗原的结合。响抗体与抗原的结合。 Western Blotting 方法一: 直接法 n优点： q1.快速（一种抗体） q2.没有二抗交叉反应引起的非 特异性条带 n缺点： q1.免疫反应性降低 q2.无信号二级放大 q3.抗体标记费时昂贵,使用不方 便 Western Blotting 方法二: 间接法 n优点： q1. 免疫特异性不受标记影响 q2. 信号放大灵敏度高（多个二 抗结合位点） q3. 多种标记的二抗可供选择 q4. 可选择不同的Marker n缺点： q1. 交叉反应引起的非特异性条 带 q2. 额外的二抗孵育以及条件优 化 间接Western Blotting操作流程: 一抗、二抗孵育 n把PVDF膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积 以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于 室温孵育1-2小时或4过夜。 n回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 n加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温 孵育1-2小时或4过夜。 n回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 n最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 二抗与底物反应显色二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 不可不加-内参的选择 n原因：校正蛋白质定量、上 样过程中存在的实验误差 n种类：GAPDH、beta-actin 、beta-tubulin n用法： q二抗孵育时加入HRP标记内参 抗体 q分子量相差不大 q分子量大小相差比较明显 Western Western BlotBlot注意事项及注意事项及 常见问题常见问题 SDS-PAGE n1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空 间，否则起不到浓缩效果。 n2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2 (载荷面即： 如果你的胶槽是5mm1mm，则载荷面为： 1mm5mm=5mm2) 。 n 3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示 TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而 且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不 够或者系统实际不纯或实效。 n4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电 泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。 SDS-PAGE n 5）电泳中常出现的一些现象： n 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中 间冷却不好。 n 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别 可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚 合不完全。 n拖尾：样品溶解不好。 n纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。 n条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。 n条带两边扩散：加样量过多。 TRANSFER n1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>= 膜>=胶。 n2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡 会造成短路。 n3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完 全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时 保持湿润（干膜法除外）。 TRANSFER n4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内 吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸 一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将 靠胶滤纸换新的。 n5）转移时间一般为1.5 小时，( 1mA- 2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整 转移时间和电流大小。 转膜及抗体检测转膜及抗体检测 uu凝胶肿胀或卷曲凝胶肿胀或卷曲 ？ uu单个单个或多个白点或多个白点 ？ uu转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热 ？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜可将凝胶在转膜之前放到转膜 缓冲液中浸泡缓冲液中浸泡5-10min5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄电转仪长期使用导致海绵变薄 ，“ “三明治三明治” ”结构不紧凑导致。结构不紧凑导致。 可在两块海绵之间垫可在两块海绵之间垫上滤纸上滤纸 确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流缓冲液中离子浓度太低，电流 或电压太高。转膜过程注意降或电压太高。转膜过程注意降 温温 1.膜没有均匀浸湿 2.膜或者缓冲液污染 3.封闭不充分 4.抗体与封闭剂出现交 叉反应 5.抗体浓度过高 原因 对 策 1.转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2.拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3.检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4.杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度 背景太高