细胞免疫荧光操作要点
4页1、细胞免疫荧光:取对数生长期细胞,用0.25胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液。将细胞接种到24孔板中,置5C02培养箱培养1天,待细胞接近长成单 层,取出孔板,4多聚甲醛37,固定30min,含1Triton X-l00的PBS溶液37作用30min增加细胞膜的通透性,非免疫动物血清37封闭40分钟,吸净血清后分孔做好标记加入抗体 (1:100),4湿盒过夜,次日预冷的PBS溶液冲洗5分钟3次后避光加入分别相应的荧光标记二抗(1:50),加入异硫氰酸荧光素 (fluoresceinisothiocyanate,FITC)(绿色)标记的二抗(1:50)置湿盒内,避光37,孵育30分钟,PBS冲洗5分 钟3次后,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(1:1000)避光37复染 细胞核20分钟。PBS冲洗5分钟3次后,使用倒置荧光显微镜(TE2000,NIKON)观察成像。阴性对照用PBS代替一抗,其余步骤同实验组相 同。1Triton X-l00所起的作用应该是溶解膜上的脂质分子,从而增加膜的通透性,使抗体容易进入细胞。一般30min
2、足以,如果是核内蛋白,可以适当增加时间。目的蛋白是NFKBp65,检测它在乳腺癌MDAMB231细胞里的核转位情况,我用的一抗二抗都是CST的,我用的步骤是1 甲醇-20度固定5分钟(建议用4多聚甲醛固定,使用多聚甲醛前(因为一般配好的多聚甲醛都放在4度冰箱内避光保存)平衡至室温再用,否则细胞会遇冷收缩,形态发生改变。不需要透膜。)2 pbs-0.2triton漂洗3次,pbs-1triton破膜15分钟,然后再洗三次洗涤液同上3 5BSA封闭1h4 一抗1:100 4度孵育了近20小时,然后洗三次5 二抗1:150避光室温1h免疫荧光第一步的步骤几注意事项1.首先是玻片的处理:泡酸去污, 冲洗, 晾干, 泡纯酒精脱脂, 蒸馏水洗(此时要用镊子夹着洗), 晾干备用.2.不知道你做的细胞是贴壁比较好的细胞比如干细胞,还是贴壁不大好的细胞比如神经元前者的话可以不用多聚赖氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚赖氨酸以免洗片时细胞掉片3. 固定,我用的是预冷纯丙酮固定15分钟(应为丙酮有毒,操作的时候小心些),这步应该注意:丙酮很容易挥发,但又要保证固定期间不能干片,所以要多滴加丙酮,其间用盖子
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