基因多态性分析
7页1、人 基因多态性分析一、实验目的1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床 表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。二、实验原理基因多态性(gene polymorphism)是指在一个生物群体中,同时存在两种及 以上的变异型或基因型或等位基因,也称为遗传多态性(genetic polymorphism)o 人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及 遗传性疾病的分子机制有重大意义;与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病 的诊断标记,并为分离克隆致病基因提供依据;病因未知的疾病与候选基因多态 性的相关性分析,可用于辅助筛选致病易感基因。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction Restriction Fragment Length Polymorphism, PCR-RFLP)分析是一种常用的 DNA 分子标记。 原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异(多态性),且变 异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上,使酶切位点
2、增加或者消失,则酶切 结果就会产生大小不同的片段,即片段长度多态性,再利用琼脂糖凝胶电泳分离, 可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较,可确定是否变异。 应用PCR-RFLP,可检测某一致病基因已知的点突变,进行直接基因诊断,也可 以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。三、器材与试剂1. 器材离心机。(2)DNA扩增仪。电泳仪。水平电泳槽。紫外检测仪。移液器。2. 试剂口腔拭子DNA抽提试剂盒。琼脂糖。(3)1xTAE电泳缓冲液:980ml蒸馏水中加入50XTAE母液20ml。50XTAE 母液:Tris 121g,0.5M EDTA(pH8.0)50ml,冰醋酸 28.55ml, 定容至500ml。上样缓冲液(6X): 30mM EDTA, 40%(V/V)甘油,0.05% (W/V)二甲 苯青FF, 0.05% (W/V)漠酚蓝。(6) 10 mg/ml 漠化乙锭(EB)。(7) DNA Marker。四、实验方法1. 基因组DNA抽提细胞采集:口腔拭子(消毒后的棉签)擦拭两侧脸颊各10次,采集口腔粘膜脱落细胞, 将拭子转置于2mL离心管中,用剪刀将棉签部分剪
3、下,加入DNA抽提试剂盒中 的400L缓冲液GA。注意:为了保证样本不被食物或者饮料污染,取样前30分钟内请勿进食和饮水。(2)DNA 提取:参照试剂盒说明书操作。样品保存:DNA产物应保存在-20C,以防DNA降解。下次实验再用。2. DNA浓度及纯度检测可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA样品的浓度与纯度。琼脂糖凝胶电泳法定性检测DNA参照实验16 DNA琼脂糖电泳。紫外分光光度法定量检测DNA浓度及纯度参照实验20动物肝脏DNA的提取和检测。测定浓度后,稀释至0.25ug/uL 备用。3.聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析查找基因序列选择你感兴趣的目的基因,首先查阅文献,如果已有报道并提供了该基因在 Genbank中的ID号,可直接在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)中搜索。登陆.ncbi.nlm.nic.gov,先选择核酸数据库, 点击下拉框选择Nucleotide,再把Genbank ID号输入搜索框,点击Search,如(图 25-1):Filter jour
4、 iMl (737) 日wdgirim rR吨eq Top OngHomo 就Radus n(Darbin 炉图25-1查找目的基因步骤1如果只是知道基因的名字,则搜索框中输入基因名称,点击search。通常会 产生大量的搜索结果,例如搜索人乙醛脱氢酶基因,search后进入如下界面(图25-2),共有700余条结果:&的的3|aldrTsave unnrts Atr;anc*dDisu启 知ttinos; 3 Summary, 20 per page. Sorted by Defaull orderSend lo;E)O Found 1050 nudeofifle sequences Nudeolide (737) EST f239 GSStuiSt# ALDH2 al加hyde 昨呵dro口财瘀 2 归in脸 Gene database3ldli2 relereric? seiuenc is Grcnk 1 TrgcripH? F rote in i2:Resorts: 1 to olPaw 1 的 37 N网 A Last*Homo gatrmns CQmMIMAirqwoaiD
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