基于泛素化机制的肺纤维化关键基因筛选与鉴定
7页1、 基于泛素化机制的肺纤维化关键基因筛选与鉴定 王志翊 周培森 李科莹 杨静雯 翁杰 徐慧特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种病因不明的慢性间质性肺病1,预后极差,生存期为35 年,由于发病机制尚未明确,目前仍无特效治疗药物2。肺纤维化病理基础是成纤维细胞过度增殖、肌成纤维细胞活化及细胞外基质异常沉积等3-4。泛素化属于蛋白翻译后修饰过程,具有选择性调节蛋白降解功能,广泛参与细胞周期调控、凋亡、信号通路转导等过程,可直接或间接参与肺纤维化进程5-6。尽管肺纤维化部分关键泛素化基因已被发现,但这些孤立的基因尚不能解释肺纤维化复杂的发病机制。近年来,微阵列分析作为在基因组水平上获得基因表达数据的一种工具,已广泛应用于疾病的发生和发展研究中7。本研究拟通过GEO 数据微阵列分析,筛查肺纤维化相关的泛素化关键基因,并通过蛋白印迹实验(WB)验证,从泛素化角度探索肺纤维化可能发病机制,为临床寻找理想的生物分子诊疗靶点提供理论依据。1 资料与方法1.1 一般资料 选取基因表达综合(geneExpression omnibus,GEO)数据库(ht
2、tp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)GSE47460 和GSE70866 两个数据集8-9。GSE47460 基于GPL14550 平台,包含91 例健康者与122 例肺纤维化患者的全肺基因表达数据。GSE70866 基于GPL14550和GPL17077 平台,包含20 例健康者与122 例肺纤维化患者的肺泡灌洗液基因表达数据。1.2 差异表达基因(DEGs)分析 数据库人群分为肺纤维化组与正常对照组,采用R 语言进行原始数据分析,通过线性模型进行微阵列分析(limma 包)筛选出DEGs,以|log2 fold change(FC)|0.5,且P1.3 PPI网络的构建 采用STRING数据库和Cytoscape软件10,构建差异基因蛋白的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,用Cytoscape 的cytoHubba 进行评分。1.4 DEGs 的功能富集分析 采用R 包“clusterProfiler”对DEGs 进行基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析,采用R 语言(enrichment plot 包和ggplot2 包)对结果进行可视化处
3、理。1.5 基于关键(Hub)基因表达高低进行预后特征的验证 通过PPI 网络筛选Hub基因,并按基因表达量中位数分为高表达组与低表达组,采用survival 包和survminer 包进行预后生存分析,比较高表达组和低表达组之间的生存差异,采用Kaplan-Meier 分析绘制生存曲线,用对数秩检验评估统计显著性。1.6 肺纤维化模型构建及泛素化Hub基因鉴定 SD 雄性大鼠18 只,体质量150200 g,采用数字随机表分为正常对照组、肺纤维化组与UCHL1抑制剂组,各6 只。用乌拉坦麻醉各组大鼠,肺纤维化组按博莱霉素(BLM)5 mg/kg 气管内灌注,UCHL1抑制剂组采用LDN-57444(LDN)(0.25 mg/kg)腹腔注射,2 周后取各组大鼠肺组织。所有SD 大鼠购自Vital River(中国上海)实验动物技术中心,本研究经温州医科大学动物实验伦理委员会批准。1.7 HE 染色和羟脯氨酸含量测定 分离大鼠肺组织,经4%多聚甲醛固定,常规脱水、包埋、切片后进行HE 染色。提取肺组织后,于试管中制成匀浆液,加入1 mL 水解液,充分混匀后加盖沸水水浴20 min,调节水
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