绿色荧光蛋白GFP基因的克隆、表达和粗提取.docx
19页1、绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学(卫生检验检疫) 摘 要目的:研究绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达,以及对其进行粗提取。 方法:从E.coli DH5中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳,确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切,并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳,用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中,用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。 结论:本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术,为进一步的实验奠定基础。 关键词:绿色荧光蛋白 基因克隆 重组表达 转化 粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1 操作流程55.2 质粒DNA的分离
2、与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3 酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物(采用DNA回收试剂盒进行回收)85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB(Luria-Bertain)液体和固体培养基的配制(参考附录)95.4.2感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5 GFP蛋白的诱导表达105.6 绿色荧光蛋白的粗提取11参 考 文 献11附 录121 LB培养基的配制:122. 溶液123. 溶液124. 溶液(100ml)125. DNase-free RNase A136.TE缓冲液(pH8.0)137. 20TBE138. GeneFinder-溴酚蓝上样缓冲液139PEGFP-N3质粒全图谱1310pET-28a质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底
3、物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年,下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素,并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年,他们分离得到了这个蛋白,当时称绿色蛋白,以后称绿色荧光蛋白(GFP)1 GFP 作为一种新的报告基因,其优点在于荧光强度高,稳定性高;GFP 分子量小,易于融合,适用于多种转化方式,对受体无毒害,安全可靠;不需要反应底物与其他辅助因子,受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测;GFP 不具有种属依赖性,在多种原核和真核生物细胞中都表达;通过替换一些特殊氨基酸,可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域 23 。采用GFP 作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段 4、5 。采用基因工程手段生产GFP标记的方法,可建立一种简便、快速的免疫诊断技术6 。质粒转化进入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞是
4、分子克隆的关键步骤7,是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前,感受态细胞的制备主要采用CaCl2 法,该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率高,可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列,并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入8。大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点9。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30%,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统10。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作,以及有大量可供选择的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株11。 随着科研的进展,构建出了多种具有不同特点的表达载体和工程菌株,以满足表达不同性质、要求的目的基因的需要。在原核细胞中表达蛋白质的载体常用启动子有T7启动子、Trp启动子-色氨酸启动子、Tac启动子、T7噬菌体中基因
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