菌种的传代、保藏及菌液的制备

菌种的传代、保藏及菌液制备标准菌种的概念及其管理 标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供菌种的名称 铜绿假单胞菌（）生孢梭菌（）大肠埃希菌（）金黄色葡萄球菌（）沙门菌（）枯草芽孢杆菌（）白色念珠菌（）黑曲霉（）微生物菌种的使用、保存与管理、验证。一.制定菌种使用保藏管理程序（1）做好菌种的来源登记，确保溯源性清楚.（2）菌种的接收与复活标准菌种的保藏形式我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。培养基的选择 细菌一般用营养琼脂培养基，特别指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基进行传代。真菌一般用改良马丁培养基。菌种的传代 菌种的复苏 菌种的确认 菌种的接种 菌种的保藏菌种的复苏 中国药典2005版规定，所用标准菌种的传代次数不得超过5代。从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直至到第3代为工作菌种。严格控制菌种的传代 避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。1.复溶菌种并转种 按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）2.鉴定菌种后制甘油冷冻管 经菌种特性鉴定后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，工作用菌种（为第三代）3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验 4.取1支（第二代）冷冻保存管转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管（第三代）斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代）5.将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。6.当工作用用菌种代数小于5时，可直接用上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接 转接第四代，直至四代转为五代。菌种保藏标签的规范与要求 菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名称，系列号，传代次数，接种时间等。一旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉处理过程应记录。严格菌种的质量控制，确保菌种的质量 菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统。因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。菌种处理的注意事项与有关记录 菌种是特殊的标准品，在一定条件下，许多种类都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于其他标准品的特殊要求。1.根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染的危害程度，要实行严密安全的保藏管理。2.所有的与菌种有关联的事情，例如菌种的接收、检查和保藏等都应有专门的微生物分析员处理和控制，建立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养特性、生化检定、传代次数、最适培养基和培养条件、保藏方法、储存条件及保存库址等。3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安全防护措施规程，采取有效预防措施进行自我保护。4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处，其他部门的人员未经允许不得进微生物实验室。所有的意外情况，都必须立即向主管部门报告以便得到及时解决。5相关记录 在菌种的使用制备与保藏过程中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录格式。菌种的确认一.初步鉴定试验 分离培养菌落形态 革兰染色菌体染色特性及菌形 生化试验检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌的种类二.全面鉴定 血清分型 毒素分析内毒素和外毒素 基因分型 蛋白组分析 自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）铜绿假单胞菌 形态特征：G-杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无芽胞、有荚膜、单端有13根鞭毛。培养特性：专性需氧，最适温度为35，但在42 生长是铜绿假单胞菌的一个特点。营养无特殊要求，普通培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成菌膜。分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基 生化反应：氧化酶试验（）（培养物呈粉红色渐变为紫红色）绿脓菌素试验（）（盐酸溶液呈粉红色）铜绿假单胞菌琼脂平板的形态铜绿假单胞菌鞭毛染色形态生孢梭菌 形态特征：G粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体革兰染色为阴性，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体，位于军体中央或近端，有周身鞭毛，能运动。培养特性：专性厌氧，但要求不严格。一般培养时不易形成芽孢，在普通营养琼脂培养基形成不规则菌落。在硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基上形成圆形、光滑、湿润、不透明的菌落。在硫乙醇酸盐流体培养基中常在其表面形成菌膜。大肠埃希菌 形态特征：G-直短杆状杆菌、无芽胞、有周身鞭毛，能运动。有菌毛。培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。分离培养：伊红美兰培养基（EMB平板）生化反应：IMViC试验结果：MUG 试验结果：荧光：大肠埃希菌EMBEMB平板菌落形态大肠埃希菌显微镜下菌体形态大肠埃希菌电镜下菌体形态金黄色葡萄球菌 形态特征：G球菌、呈单个、成双、短链或排列呈葡萄串样，无鞭毛、芽胞。培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、隆起、边缘整齐、不透明的菌落。菌落因种不同而出现不同的色素。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。分离培养：高盐甘露醇培养基 生化反应：血浆凝固酶试验结果：金黄色葡萄球菌显微镜下菌体形态金黄色葡萄球菌电镜下菌体形态沙门菌 形态特征：G-直 杆菌、无芽胞、无荚膜、多具有周身鞭毛，能运动。有菌毛。培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上可生长，形成圆形、光滑、湿润、半透明、边缘整齐的菌落。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。分离培养：沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)琼脂培养基 生化反应：三糖铁琼脂反应：碱/酸，葡萄糖产气，H2S阳性多价血清凝集试验：阳性沙门菌SSSS平板菌落形态沙门菌显微镜下菌体形态沙门菌血清凝集试验结果枯草芽孢杆菌 形态特征：G直杆菌、多呈链状排列，有鞭毛、有芽胞，位于菌体中心或次极端，不小于菌体。培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落。在营养肉汤培养基中形成菌膜,很少混浊或不混浊。分离培养：营养琼脂平板血琼脂平板枯草芽孢杆琼脂平板的形态枯草芽孢杆显微镜下菌体形态真菌的初步鉴定试验 标本直接检查显微镜检查 真菌的分离培养.酵母型菌落：是单细胞真菌的菌落。形态与一般细菌菌落相似，但较大些，菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，有部分单细胞真菌可在培养基中形成假菌丝，此菌落称为类酵母型菌落。.霉菌型菌落：是多细胞真菌的菌落。菌落成棉絮状、绒毛状、粉末状，并产生不同的色素。快速显色鉴别培养法：经3712d就能显示结果。如白色念珠菌呈绿色或蓝绿色菌落，黑曲霉呈白色丝状菌落，里面呈淡粉红色，一周后逐渐变成黑色。霉菌各种菌落形态白色念珠菌 形态特征：G、圆形或卵圆形、着色不均匀、在玉米培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成灰白色、表面光滑、带有浓重酵母气味的典型的类酵母菌落。培养稍久，菌落增大。在改良马丁培养基中呈沉淀生长。分离培养：快速显色培养基白色念珠菌显色平板的形态白色念珠菌显微镜下菌体形态黑曲霉 形态特征：单层和双层瓶梗、孢子头球形放射状、褐至黑色、孢子梗无色至褐色。培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成菌落初为白色羊毛状，继而黑色或黑褐色，粗绒状。分离培养：快速显色培养基黑曲霉显微镜下菌体形态黑曲霉电镜下菌体形态菌种传代的工作环境、工具及其他器皿 环境1、洁净工作室：环境洁净度10000级下的局部100级的单向流空气区域内，全过程必须无菌操作，防止微生物污染。2、无菌隔离舱 工具1、接种环2、接种针3、接种铲4、接种钩5、酒精灯及其他玻璃器械 培养所用器具1、玻璃器皿：如各种规格培养皿。2、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌锅、恒温培养箱等菌种的接种操作步骤一.斜面接种法：1.从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。2.将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入接种室或超净工作台。打开紫外灯照射一小时。3.关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。5.塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。6.取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。7.将已接种好的细菌管置3537细菌培养箱培养22 24h，霉菌管置2328霉菌培养箱培养7天。二.穿刺接种法：用接种针取细菌少许，从培养基的中央垂直刺入，接近管底但不接触管底，然后接种针沿穿刺线原路退出。主要用于生孢梭菌的传代。三.液体接种法：用接种针取菌少许，在试管内壁与液面交界处的管壁上轻轻研磨，使菌混合于培养液中。黑曲霉接种方法：黑曲霉孢子悬液，可以保存在4环境，并应在一个月内尽快完成转种操作。转种操作应在超净工作台（或相当此环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯，拧开瓶盖，用无菌吸管吹吸管内液体，取12滴滴在改良马丁琼脂斜面，用吸管涂布均匀，置2328培养57日，培养斜面形态可参照下图。如上图，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。转种完毕的冻存管和使用过的器具应经121湿热灭菌30分钟再作处理。菌种的保藏菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。一、菌种保藏的目的n 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、二、菌种保藏的原理 首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株三、菌种保藏方法 各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。斜面低温保藏法 甘油冷冻管保藏法 试管熔封（密封）保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法（一）斜面低温保藏法常用保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续。此法适用于细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏短期保藏.此法的主要保藏措施是低温。一般可保存16个月左右。优点：简便易行、容易推广，适用于大多数微生物 缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短；传代次数多；菌种容易发生变异和被污染。（二）甘油冷冻管保藏法 将待保藏菌种接种在适宜的斜面培养基上，适宜