二代测序产品质量控制及思考
二代测序产品质量控制及思考黄杰非传染病诊断试剂室中国食品药品检定研究院报告内容二代测序诊断试剂产品试剂标准化方案及临床问题面临的挑战测序发展历程正在研发2005年开始20世纪80年代中期第三代DNA测序技术是以单分子测序为特点，如生物科学公司的单分子测序仪，以及正在研制的太平洋生物科学公司的单分子实时DNA测序技术和牛津纳米孔技术公司的纳米孔单分子测序技术等主要包括罗氏454公司的454测序技术、Illumina公司的Solexa测序技术和Life Technologies公司的Ion Torrent测序技术。第二代测序技术最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的测序技术统称为第一代测序。它在分子生物学研究中发挥过重要的作用，如人类基因组计划目前常说的高通量测序是指用第二代测序技术来进行测序，第三代测序技术还不是很成熟，有的刚刚出现，有的则正在研制。NGS临床应用外来基因致病基因感染 肿瘤生育 遗传突变基因易感基因 NIPT（无创产前检验）胚胎植入前筛查（PGS）、PGD 肿瘤：肺癌，结直肠癌，乳腺癌 遗传性耳聋、地贫 人乳头瘤病毒核酸分型 HLA分型：移植前配型 药物基因组学 法医.CFDA已批准的部分NGS测序仪和试剂盒序号产品名称注册证号1234567国食药监械(准)字2014 3401126基因测序仪基因测序仪基因测序仪基因测序仪基因测序仪基因测序仪第号国食药监械(准)字2014 3401127第号国械注准国械注准国械注准国械注准20143401961201434021712015340030920153400460胎儿染色体非整倍体剂盒(半导体测序法)(T21 T18 T13)检测试 国食药监械 准 字、()2014 3401128第号8(T21 T18 T13)()2014 3401129检测试 国食药监械 准 字 第胎儿染色体非整倍体剂盒(联合探针铆钉连接测序法)、号9(T21 T18 T13)20153400300胎儿染色体非整倍体剂盒(半导体测序法)、检测试 国械注准1011(T21 T18 T13)2014340196020153400461胎儿染色体非整倍体剂盒(半导体测序法)、检测试 国械注准胎儿染色体非整倍体盒(可逆末端终止测序法)(T13/T18/T21)检测试剂 国械注准报告内容二代测序诊断试剂产品试剂标准化方案及临床问题面临的挑战NGS 检测分为实验操作和数据分析SPECIMENT 样本样本处理 数据库 算法 分析软件扩增均匀度及偏倚性建库文库的质量准确性DNA/RNALIBRARY 文库特异性检测限SEQUENCING 测序BASECALLING 碱基鉴别ALIGNMENT 拼接过滤参数及准确性参考序列或参考数据库VARIANT CALLING 突变鉴别ANNOTATION/FILTERING/CLASSIFICATION 交叉 解读可靠性确认报告范围及内容INTERPRETATION 解读REPORT 报告高通量测序仪器性能标准化半导体测序SOLiD链接酶测序Illumina可逆末端终止测序PacBioCompleteGenomicsNanoporePGM/Proton454联合探针锚定合成测序 焦磷酸测序Sequencing using semi-conductor chipSequencing forsingle moleculeSequencing using CCD测序仪性能评价用基因组DNA国家参考品采用实物与参考序列的方式进行评价，将参考序列作为了标准技术指标：测序仪性能评价用脱氧核糖核酸参考品技术指标（二代测序仪评价）：1.测序准确性2.重复性测序仪性能评价用脱氧核糖核酸参考品技术指标（一代测序仪评价）：1.测序准确性2.重复性2.5G参考品30M参考品原始数据Length30,324,0622,495,071,5683,095,693,981GC39.90%50.98%43.28%8.54%40.90%50.35%RepeatGapLength%0.00%80.60%0.00%0.98%7.66%-人基因组标准品序列在各染色体的分布，第二圈蓝色为标准品选择区域，第三圈灰色为Gap区域NGS检测试剂标准化质量控制技术评价指南基于孕妇游离DNA的胎儿染色体非整倍体检测试剂质量控制技术评价指南（高通量测序法）胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂的质量控制技术评价指南(高通量测序法)高通量测序检测外周血胎儿染色体非整倍体试剂标准化 胎儿游离DNA的发现基基本特点本特点：来来源源：1）含量有一定的变变化化规规律律。妊娠第5周开始可检出胎儿游离DNA，随着孕周增加而增加，但存在个体差异；1 胎儿细胞通过胎盘渗透到母血中，被母体免疫系统破坏，胎儿DNA残留下来；2）分娩后短短时间时间内消失内消失，平均半衰期为16.3min(4-30min)，2h就无法检出。再次妊娠不影响检测结果；2 胎儿细胞凋亡；3 胎盘滋养层细胞的凋亡。3）DNA片段片段较较小小，平均166bp左右。常规技术很难检测。高通量测序检测外周血胎儿染色体非整倍体以21-三体为例：100 DNA单位/毫升血浆。其中，95个单位来源于母亲，5个单位来源于胎儿母母亲亲Chr 21：952=190正常胎儿正常胎儿Chr 21：52=10母体外周血母体外周血中中Chr 21=190+10=200经过经过计数与比较：计数与比较：正常胎儿正常胎儿 或者或者 21-三体胎儿三体胎儿母母亲亲Chr 21：952=19021-三体胎儿三体胎儿Chr 21：53=15母体外周血母体外周血中中Chr 21=190+15=205Fan et al.,PNAS,2008Chiu et al.,PNAS,2008技术和产品影响因素分析母亲外周血中胎儿游离DNA的含量胎儿三体的不同类型如标准三体、嵌合体以及平衡易位突变DNA序列差异对结果有影响，特别是高GC含量序列对结果文库构建中的偏移，测序文库的库容和量在软件分析中采用的算法主要基于统计学原理，在结果分析中原始数据是否符合统计学要求女胎、双胞胎以及多胞胎对结果的影响孕妇本人为“染色体非整倍体”患者，夫妇双方或一方为染色体结构异常者孕妇前期接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗等引入的外源DNANIPT定量方法比较 胎儿游离DNA浓度测定：QubitAgilent 2100片段长度估计算法Y染色体法多重SNP法（荧光PCR法/数字PCR）保守基因检测法（荧光PCR法）胎儿DNA浓度定量-片段长度Size ratio=P(100-150)/P(163-169)P(100-150)100-150bp片段的比例P(163-169)163-169bp片段的比例 受建库过程的影响胎儿DNA浓度定量-甲基化Step 2:甲甲基基化特异性化特异性的的RE消化消化Step 1:游离游离DNA提提取取非甲基化的母体 DNA（C）甲基化的胎儿 DNA（D）Step 4:核核酸酸质谱质谱分析分析反反应产物应产物CStep 3:竞竞争性争性PCR和和单单碱碱基基延伸延伸D胎儿浓度与孕周 98%以上样本胎儿浓度4%胎儿浓度和孕妇孕周正相关 胎儿浓度与孕妇体重负相关NIPT算法介绍目前NIPT数据分析算法主要包括以下三种，这三种算法的主要差异在于使用了不同的方法构建参考数据库。常规U检验算法 NCV(Normalized Chromosome Value)算法 MAD(Median Absolute Deviation)算法参考文献：1.Chiu RWK,et al.(2008)Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA inmaternal plasma.Proc Natl Acad Sci USA2.Amy J.Sehnert,et al.(2011)Optimal Detection of Fetal Chromosomal Abnormalities by Optimal Detection of Fetal ChromosomalAbnormalities by from Maternal Blood.Clinical Chemistry3.Glenn E.Palomaki,et al.(2011)DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome:An international clinical validation study.Genetics IN Medicine模拟不同测序数据量对检出影响高通量测序用外周血胎儿染色体非整倍体（T21、T18和T13）国家参考品 数据量控制参考品 阳性参考品 微缺失微重复参考品 嵌合体参考品 检测限参考品 阴性参考品NIPT的假阴性、假阳性Biological/Technical explanation(n=60,33%)False positives(n=182,88%)T21(n=65,36%)T18(n=59,32%)T13(n=47,26%)Maternal CNV(n=29,48%)CPM(n=19,32%)Maternal malignancy(n=9,15%)Maternal mosaicism(n=1,2%)Vanished twin(n=1,2%)T9(n=1,0.5%)T22(n=1,0.5%)Maternal and fetal Chr 21 duplication(n=1,2%)Monosomy 18(n=1,0.5%)Multiple(n=8,4%)No explanation(n=122,67%)Included cases(n=206)False negativesBiological/Technical explanation(n=13,54%)TFM T21(n=3,23%)(n=24,12%)T21(n=10,42%)T18(n=9,38%)TFM T18(n=5,38%)TFM T13(n=2,15%)TFM multiple aneuploidies(n=2,15%)Incorrect annotation(n=1,8%)T13(n=3,13%)48,XXX,+18(n=1,4%)47,XY,+21/48,XY,+18,+21(n=1,4%)No explanation(n=11,46%)TFM:True fetal mosaicismHartwig TS.Prenat Diagn.2017 Apr 5.doi:10.1002/pd.5049.NIPT与移植、免疫治疗 After organ transplantation,donor-derived cell-freeDNA(ddcfDNA)can be detected in the recipient sblood and urineGielis EM.Am J Transplant.2015 Oct;15(10):2541-51.doi:10.1111/ajt.13387.De Vlaminck I.Sci Transl Med.2014 Jun 18;6(241):241ra77.doi:10.1126/scitranslmed.3007803.NIPT与核型不一致（母体母体肿肿瘤瘤）Amant F,et al.JAMA Oncol.2015 Sep;1(6):814-9.Bianchi,DW,et al.JAMA.2015 Jul 14;314(2):162-9.NIPT热点议题NIPT，即无创产前检测，Non-invasive Prenatal Testing首字母缩写主流检测技术是对孕妇外周血浆cffDNA 高通量测序分析ISPD 2013：
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二代测序产品质量控制及思考黄杰非传染病诊断试剂室中国食品药品检定研究院报告内容二代测序诊断试剂产品试剂标准化方案及临床问题面临的挑战测序发展历程正在研发2005年开始20世纪80年代中期第三代DNA测序技术是以单分子测序为特点，如生物科学公司的单分子测序仪，以及正在研制的太平洋生物科学公司的单分子实时DNA测序技术和牛津纳米孔技术公司的纳米孔单分子测序技术等主要包括罗氏454公司的454测序技术、Illumina公司的Solexa测序技术和Life Technologies公司的Ion Torrent测序技术。第二代测序技术最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的测序技术统称为第一代测序。它在分子生物学研究中发挥过重要的作用，如人类基因组计划目前常说的高通量测序是指用第二代测序技术来进行测序，第三代测序技术还不是很成熟，有的刚刚出现，有的则正在研制。NGS临床应用外来基因致病基因感染 肿瘤生育 遗传突变基因易感基因 NIPT（无创产前检验）胚胎植入前筛查（PGS）、PGD 肿瘤：肺癌，结直肠癌，乳腺癌 遗传性耳聋、地贫 人乳头瘤病毒核酸分型 HLA分型：移植前配型 药物基因组学 法医.CFDA已批准的部分NGS测序仪和试剂盒序号产品名称注册证号1234567国食药监械(准)字2014 3401126基因测序仪基因测序仪基因测序仪基因测序仪基因测序仪基因测序仪第号国食药监械(准)字2014 3401127第号国械注准国械注准国械注准国械注准20143401961201434021712015340030920153400460胎儿染色体非整倍体剂盒(半导体测序法)(T21 T18 T13)检测试 国食药监械 准 字、()2014 3401128第号8(T21 T18 T13)()2014 3401129检测试 国食药监械 准 字 第胎儿染色体非整倍体剂盒(联合探针铆钉连接测序法)、号9(T21 T18 T13)20153400300胎儿染色体非整倍体剂盒(半导体测序法)、检测试 国械注准1011(T21 T18 T13)2014340196020153400461胎儿染色体非整倍体剂盒(半导体测序法)、检测试 国械注准胎儿染色体非整倍体盒(可逆末端终止测序法)(T13/T18/T21)检测试剂 国械注准报告内容二代测序诊断试剂产品试剂标准化方案及临床问题面临的挑战NGS 检测分为实验操作和数据分析SPECIMENT 样本样本处理 数据库 算法 分析软件扩增均匀度及偏倚性建库文库的质量准确性DNA/RNALIBRARY 文库特异性检测限SEQUENCING 测序BASECALLING 碱基鉴别ALIGNMENT 拼接过滤参数及准确性参考序列或参考数据库VARIANT CALLING 突变鉴别ANNOTATION/FILTERING/CLASSIFICATION 交叉 解读可靠性确认报告范围及内容INTERPRETATION 解读REPORT 报告高通量测序仪器性能标准化半导体测序SOLiD链接酶测序Illumina可逆末端终止测序PacBioCompleteGenomicsNanoporePGM/Proton454联合探针锚定合成测序 焦磷酸测序Sequencing using semi-conductor chipSequencing forsingle moleculeSequencing using CCD测序仪性能评价用基因组DNA国家参考品采用实物与参考序列的方式进行评价，将参考序列作为了标准技术指标：测序仪性能评价用脱氧核糖核酸参考品技术指标（二代测序仪评价）：1.测序准确性2.重复性测序仪性能评价用脱氧核糖核酸参考品技术指标（一代测序仪评价）：1.测序准确性2.重复性2.5G参考品30M参考品原始数据Length30,324,0622,495,071,5683,095,693,981GC39.90%50.98%43.28%8.54%40.90%50.35%RepeatGapLength%0.00%80.60%0.00%0.98%7.66%-人基因组标准品序列在各染色体的分布，第二圈蓝色为标准品选择区域，第三圈灰色为Gap区域NGS检测试剂标准化质量控制技术评价指南基于孕妇游离DNA的胎儿染色体非整倍体检测试剂质量控制技术评价指南（高通量测序法）胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂的质量控制技术评价指南(高通量测序法)高通量测序检测外周血胎儿染色体非整倍体试剂标准化 胎儿游离DNA的发现基基本特点本特点：来来源源：1）含量有一定的变变化化规规律律。妊娠第5周开始可检出胎儿游离DNA，随着孕周增加而增加，但存在个体差异；1 胎儿细胞通过胎盘渗透到母血中，被母体免疫系统破坏，胎儿DNA残留下来；2）分娩后短短时间时间内消失内消失，平均半衰期为16.3min(4-30min)，2h就无法检出。再次妊娠不影响检测结果；2 胎儿细胞凋亡；3 胎盘滋养层细胞的凋亡。3）DNA片段片段较较小小，平均166bp左右。常规技术很难检测。高通量测序检测外周血胎儿染色体非整倍体以21-三体为例：100 DNA单位/毫升血浆。其中，95个单位来源于母亲，5个单位来源于胎儿母母亲亲Chr 21：952=190正常胎儿正常胎儿Chr 21：52=10母体外周血母体外周血中中Chr 21=190+10=200经过经过计数与比较：计数与比较：正常胎儿正常胎儿 或者或者 21-三体胎儿三体胎儿母母亲亲Chr 21：952=19021-三体胎儿三体胎儿Chr 21：53=15母体外周血母体外周血中中Chr 21=190+15=205Fan et al.,PNAS,2008Chiu et al.,PNAS,2008技术和产品影响因素分析母亲外周血中胎儿游离DNA的含量胎儿三体的不同类型如标准三体、嵌合体以及平衡易位突变DNA序列差异对结果有影响，特别是高GC含量序列对结果文库构建中的偏移，测序文库的库容和量在软件分析中采用的算法主要基于统计学原理，在结果分析中原始数据是否符合统计学要求女胎、双胞胎以及多胞胎对结果的影响孕妇本人为“染色体非整倍体”患者，夫妇双方或一方为染色体结构异常者孕妇前期接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗等引入的外源DNANIPT定量方法比较 胎儿游离DNA浓度测定：QubitAgilent 2100片段长度估计算法Y染色体法多重SNP法（荧光PCR法/数字PCR）保守基因检测法（荧光PCR法）胎儿DNA浓度定量-片段长度Size ratio=P(100-150)/P(163-169)P(100-150)100-150bp片段的比例P(163-169)163-169bp片段的比例 受建库过程的影响胎儿DNA浓度定量-甲基化Step 2:甲甲基基化特异性化特异性的的RE消化消化Step 1:游离游离DNA提提取取非甲基化的母体 DNA（C）甲基化的胎儿 DNA（D）Step 4:核核酸酸质谱质谱分析分析反反应产物应产物CStep 3:竞竞争性争性PCR和和单单碱碱基基延伸延伸D胎儿浓度与孕周 98%以上样本胎儿浓度4%胎儿浓度和孕妇孕周正相关 胎儿浓度与孕妇体重负相关NIPT算法介绍目前NIPT数据分析算法主要包括以下三种，这三种算法的主要差异在于使用了不同的方法构建参考数据库。常规U检验算法 NCV(Normalized Chromosome Value)算法 MAD(Median Absolute Deviation)算法参考文献：1.Chiu RWK,et al.(2008)Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA inmaternal plasma.Proc Natl Acad Sci USA2.Amy J.Sehnert,et al.(2011)Optimal Detection of Fetal Chromosomal Abnormalities by Optimal Detection of Fetal ChromosomalAbnormalities by from Maternal Blood.Clinical Chemistry3.Glenn E.Palomaki,et al.(2011)DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome:An international clinical validation study.Genetics IN Medicine模拟不同测序数据量对检出影响高通量测序用外周血胎儿染色体非整倍体（T21、T18和T13）国家参考品 数据量控制参考品 阳性参考品 微缺失微重复参考品 嵌合体参考品 检测限参考品 阴性参考品NIPT的假阴性、假阳性Biological/Technical explanation(n=60,33%)False positives(n=182,88%)T21(n=65,36%)T18(n=59,32%)T13(n=47,26%)Maternal CNV(n=29,48%)CPM(n=19,32%)Maternal malignancy(n=9,15%)Maternal mosaicism(n=1,2%)Vanished twin(n=1,2%)T9(n=1,0.5%)T22(n=1,0.5%)Maternal and fetal Chr 21 duplication(n=1,2%)Monosomy 18(n=1,0.5%)Multiple(n=8,4%)No explanation(n=122,67%)Included cases(n=206)False negativesBiological/Technical explanation(n=13,54%)TFM T21(n=3,23%)(n=24,12%)T21(n=10,42%)T18(n=9,38%)TFM T18(n=5,38%)TFM T13(n=2,15%)TFM multiple aneuploidies(n=2,15%)Incorrect annotation(n=1,8%)T13(n=3,13%)48,XXX,+18(n=1,4%)47,XY,+21/48,XY,+18,+21(n=1,4%)No explanation(n=11,46%)TFM:True fetal mosaicismHartwig TS.Prenat Diagn.2017 Apr 5.doi:10.1002/pd.5049.NIPT与移植、免疫治疗 After organ transplantation,donor-derived cell-freeDNA(ddcfDNA)can be detected in the recipient sblood and urineGielis EM.Am J Transplant.2015 Oct;15(10):2541-51.doi:10.1111/ajt.13387.De Vlaminck I.Sci Transl Med.2014 Jun 18;6(241):241ra77.doi:10.1126/scitranslmed.3007803.NIPT与核型不一致（母体母体肿肿瘤瘤）Amant F,et al.JAMA Oncol.2015 Sep;1(6):814-9.Bianchi,DW,et al.JAMA.2015 Jul 14;314(2):162-9.NIPT热点议题NIPT，即无创产前检测，Non-invasive Prenatal Testing首字母缩写主流检测技术是对孕妇外周血浆cffDNA 高通量测序分析ISPD 2013：
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