临床基因扩增检验的质量保证 李金明 国家卫生计生委临床检验中心

临床基因扩增检验的质量保证李金明 国家卫生计生委临床检验中心Tel.010-58115061Email:2017.3.29 江苏基因扩增培训班？什么叫质量保证？与质量控制有何区别？室内质控？室间质评？基因突变和基因多态性检测如何进行室内质控？分子诊断的报告？涉及临床医生标本采集环节和实验室检验申请单；标本采集、运送和保存（分析前）质量保证(QualityAssurance,QA)：为一产品或服务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施质量保证结果报告解释及临床应用（分析后）室内质控（分析中）涉及实验室人员和临床医生涉及实验室质量控制室间质评（分析中）涉及实验室室内质量控制（Internal Quality Control,IQC)？由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。可概括为:1.执行者（Who）：实验室技术人员；2.目 的（Why）：监测实验室测定的精密度（重复性）；提高常规检测结果一致性（质量的持续改进）；决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的即时性评价。室间质量评价（External Quality Assessment,EQA）为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定在实时的测定结果的可接受性。当EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为实验室能力验证（Proficiency testing,PT）。在以前的文献中，EQA常描述室间质量控制。可概括为:1.执行者（Who）：外单位机构；2.目 的（Why）：监测实验室测定的准确度（可比性）；使各实验室结果具有可比性（质量的持续改进）；是对实验室测定的回顾性评价。3.EQA与PT的区别：前者自我教育（self-educatio），后者为执业许可或实验室认可，有强制性意义。质量保证的关键点 检验申请单是合适的：对“Who”在“When”开出“What”申请单 标本是正确的和好的：采集、运送和保存 实验室环境条件是好的：温湿度、可能的干扰的涉及临床医生标本采集环节和实验室避免（分区、灰尘、电磁、振动等）检测申请单、标本采集、运送和保存（分析前）仪器设备状态是好的：维护、定期校准 试剂是好的：性能验证或性能确认、批质检 实验室人员是有能力的：外部和内部培训，能力结果报告解释及临床应用（分析后）室内质控（分析中）质量保证评估涉及实验室人员和临床医生 SOP的可操作性及全员遵循涉及实验室 得到结果的过程是有监控的：室内质量控制和室室间质评（分析中）间质量评价（或实验室间比对）涉及实验室 针对差错、投诉、失控等分析原因采取措施的质量持续改进 临床医生能正确的理解和应用检验结果于患者疾病的诊断和治疗分析前检验申请单和标本采集、运送和保存中的关键点 对“Who”在“When”开出“What”申请单 容器：密闭的、一次性、无菌、无核酸酶及其他扩增抑制物 采集方法：人（训练有素）、防污染、处理 运送保存时间和温度：尽可能快？低温？合格标本:容器完整、量够、时间符合要求、外观符合要求、处理符合要求对“Who”在“When”开出“What”申请单以染色体非整倍体NIPT为例对“Who”在“When”开出“What”申请单开展孕妇外周血胎儿游离DNA实验室检测的医疗机构（以下简称检测机构）应当具备临床基因扩增检验实验室资质，严格遵守医疗机构临床实验室管理办法、医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法等相关规定，相应检验项目应当接受国家卫生计生委临床检验中心组织的室间质量评价。从事孕妇外周血胎儿游离DNA产前检测的实验室人员应当经过省级以上卫生计生行政部门组织的临床基因扩增检验技术培训，并获得培训合格证书。Who 适用人群（一）血清学筛查显示胎儿常见染色体非整倍体风险值介于高风险切割值与1/1000之间的孕妇。（二）有介入性产前诊断禁忌证者（如先兆流产、发热、出血倾向、慢性病原体感染活动期、孕妇Rh阴性血型等）。（三）孕20+6周以上，错过血清学筛查最佳时间，但要求评估21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征风险者。慎用人群有下列情形的孕妇进行检测时，检测准确性有一定程度下降，检出效果尚不明确；或按有关规定应建议其进行产前诊断的情形。包括：（一）早、中孕期产前筛查高风险。（二）预产期年龄35岁。（三）重度肥胖（体重指数40）。（四）通过体外受精胚胎移植方式受孕。（五）有染色体异常胎儿分娩史，但除外夫妇染色体异常的情形。（六）双胎及多胎妊娠。When：12 22 周（七）医师认为可能影响结果准确性的其他情形。+0+6What：NIPT 不适用人群有下列情形的孕妇进行检测时，可能严重影响结果准确性。包括：（一）孕周10次/小时）“无基因”或“无核酸”概念的重要性！尊敬的李教授：您好！刘大夫：PCR实验室一旦出现严重污染，消除将会比较困难，通常可采用下述方法：（1）开窗通风;（2）采用次氯酸钠溶液擦地面及实验台来信请教一个问题，具体情况是这样的：我这儿使用的PCR仪是ABI 7300，用的是达安公司的HBV-DNA试剂，去年12月中旬的一次试验中发生了爆管事件，事件发生后，已经按照SOP规程进行了消毒处理，到现在已经有半年了，可还是不能消除污染。PCR实验室在三楼，现在即使加样操作放在同一幢楼房的一楼进行，其余如混匀、温育、离心等还放在原来的实验室，扩增也在原来的实验室，阴性对照孔所加对照都未如标本一样处理（因此暴露在空气中的时间很短），可是 阴性对照孔仍有扩增，大约在21个循环的时候开始，阴性对照显示的Ct约为26左右。请问这是什么原因，怎么处理才能消除污染。盼指点！面，甚至墙面;（3）增长紫外照射时间；（4）用75%乙醇空中喷雾，然后用于次氯酸钠溶液擦地面及实验台面。上述措施每天都要进行，直至污染消除。不知你是否按上述方法进行？如没有，你可以这样试，并请将效果告诉我。此外，在实验室出现严重污染后，如还要进行工作，则可临时更换一个厂家试剂，应就可以。刘X2013050820130508尊敬的李教授：李教授：您好！我是上次向您请教PCR实验室污染如何清除的小刘，我们按照您的指点进行处理，现在实验室污染已经完全清除，非常感谢！以后我们会更加注意操作的规范及相关知识的学习！您好！您所说的措施我都实行过，只不过除通风外，其余措施仅实施过很少几次，我将按您所说措施处理一段时间再看看。另外，再请教两个问题：（1）上述措施要在三个区都进行吗？（2）楼房第三层污染，在第一层操作怎么也会受到影响？谢谢您拨冗指教！2013.7.18刘X20130508尊敬的李教授：您好！我是XX市XXXX医院的检验科的孔XX，来信请教您一个问题，具体情况是这样的：我们这里使用的PCR仪是上海宏石的SLAN，试剂是湖南圣湘的HBV DNA试剂，11月初在做实验的时候发现阴性对照孔有扩增，排除试剂污染及人为偶然因素后，阴性对照孔仍有扩增，在实验时，我们放置在1室、2室空气暴露的PCR反应管，用蒸馏水当样本检验，大约23个循环的时候开始扩增，阴性对照显示的Ct值约为27，可能是由于不同区域的拖把混用导致的实验室污染，现在我们每天都用2000mg/L的有效氯消毒，擦拭台面、地面，甚至墙面，75%的酒精擦拭移液器，生物安全柜等，到目前为止，污染仍不能去除。请问怎么处理才能快速的消除污染，盼指点！孔XXXX市XXXX医院的检验科2016.11.28“文字”加“图片”的SOP能给我们带来什么？有一个SOP很容易有一个可操作性的SOP很难吗？SOP装订成册？SOP的第一版、第二版、第三版、？SOP文件在什么时候需要修改？“修”一个东西的前提是这个东西一定是出了“问题”或“故障”！发现SOP有“故障”的途径：室内质控和室间质评失控、差错、投诉、评审的不符合项、实验室仪器设备及管理 加样器：维护、校准 扩增仪：维护、校准 恒温干浴仪或水浴箱：维护、校准 离心机：维护 生物安全柜：维护 冰箱：维护基因扩增仪器设备的质控仪器设备质控方法频 度失控标准扩增仪仪器校验实验当仪器移动时实验失败热电偶监测温度扩增功能检测每月一次每4个月一次如靶温度或温度差异超出允许范围待测孔未出现扩增，检测温度程序打印校准每次测定时每年2次打印程序不对不符合要求不符合要求加样器水浴箱温度检测每次实验人员培训 方法原理 核酸扩增检测的关键环节 仪器设备使用、维护和校准 结果的分析、报告及进一步处理 质控的分析 知其然又知其所以然。实验室内部培训存在的问题人员少，实际上没有内部培训形式没有年度培训计划没有培训记录实验室人员内部培训的重要性 外部培训提供的是“理念”，是被动的，更多的是“学习”内部培训是主动的，源于实践，高于实践，更多的是“思考”内部培训所涉及的范围试剂、方法原理专业其他质量控制方法相关领域的新技术理论相关法律法规质量管理体系新理念和新进展仪器设备使用、维护和校准操作实验操作技能如何培训书面考试实验考核讨论心得培训评估论文综述问题的解决报告室内质控方法非统计学方法统计质控方法非统计学方法 在检测临床标本的同时，检测一定数量（与临床样本的数量相适应）的已知弱阳性（与试剂宣称的测定下限相适应）和阴性的质控样本 检测有效的质控判断方法：阳性检测为阳性（反应性），阴性检测为阴性（非反应性）。SNP、突变等定性检测质控品从哪来？日常检验阳性样本的收集或永生化细胞系，制备成含一定比例突变的质控样本弱阳性质控品：浓度为试剂盒检测限2-4倍的样本较强阳性质控样本？阴性质控品：日常检验的阴性标本或从野生型细胞系制备得到突变及SNP每批检测的质控如何做？每批临床标本检测：带入其中12种突变或基因型较弱阳性（一定突变%）样本以及野生型样本，随机放置于临床标本中间进行检测。在一定时间内将所有已有质控品的突变全部轮到。质控规则：弱阳性质控样本检测为相应阳性，阴性为野生型，即为在控。否则为失控。常用统计学质控方法Levey-Jennings质控图假阳性统计质控方法质控物浓度的选择 定量测定：测定线性范围内的高、中、低三种浓度 定性测定：接近方法测定下限（2-4倍）的浓度 阴性质控物临床基因扩增检验IQC统计计算问题 可使用质控样本扩增后的IU/ml来进行统计计算，也可用其对数值进行。由于基因扩增结果的原始数据通常很大，可能不呈正态分布，故使用其对数值来进行质控统计分析。室内质控品的放置每隔一定数量（？随机？）的临床标本加入一个质控品（定性包括阳性和阴性）Levey-Jennings质控图常用质控规则的符号及定义符 号12S定 义1个质控测定值超出均值2SD控制限1个质控测定值超出均值3SD控制限2个连续的质控测定值同时超出均值+2SD或2SD控制限13S22SR4S同一批测定中，2个不同浓度质控品测定值之间的差值超出4SD控制限41S7T4个连续的质控测定值同时超出均值+1SD或1SD控制限7个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化10个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧10X多规则质控QC Data Concept 1977 Example 198112sReport Results“Westgard Rules”1 2 R 4 103s2s4s1sxTake Corrective Action“假阳性”的统计学室内质控方法基于日常检验的阳性率比值（呈正态分布）直接概率计算方法（不呈正态分布）基于日常检验的阳性率比值半Levey-Jennings质控图法质控规则 当阴性质控样本为阳性时,不管阳性率测定比值为何，均为失控，所有阳性标本须重新测定，并增加一倍阴性质控样本。如果阴性质控样本为阴性，某次测定阳性比值超出+3SD,则为失控,为1+3S规则。本次结果阴性结果根据阳性质控样本的情况,