细胞工程：2植物人工繁殖.ppt

1第2讲 植物人工繁殖2o本节主要内容o 1、组织培养再生植物o 2、人工种子o本节重要问题o 1、细胞全能性、细胞分化与脱分化o 2、激素在细胞分化中的调节作用o 3、植物经组织培养的再生途径3基本概念：细胞全能性细胞分化脱分化再分化41细胞全能性o细胞全能性(totipotency)：指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能o1902年，德国植物学家哈伯兰德(Haberlandt)提出了细胞全能性学说，预言植物细胞具有全能性n 细胞全能性首先在植物中被证实1958年，史都华德（Steward）等利用胡萝卜根韧皮部组织培养出了完整的新植株，证明高度分化的植物营养组织仍保持着发育成完整植株的能力，以无性繁殖方式繁殖后代n 1960年，Morel提出了离体无性繁殖兰花的新方法，其繁殖系数之高，可谓始料不及，于是很快被兰花生产者所采用，从而在西方迅速建立起了“兰花工业”可以说，这是植物组织培养技术第一次在园艺作物上形成规模化的生产应用52 细胞分化o细胞分化（Differentiation）是指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，包括时间上和空间上的分化。

n 时间上的分化是指一个细胞在不同的发育阶段可以形成不同的形态和功能；n 空间上的分化是指同一种细胞由于所处的环境或部位不同可以形成不同的形态和功能细胞分化能力的强弱称为发育潜能o细胞分化与形态发生（Morphogenesis）是相互联系在一起的形态发生是指通过细胞增殖、分化和行为塑造组织、器官和个体形态的过程 6细胞分化的实质是基因的差异表达o 细胞分化的实质是基因的差异表达（Differential expression）, 是奢侈基因按照一定顺序表达的结果o 一些特定奢侈基因表达的结果生产一种类型的分化细胞n 在基因差异性表达中包括结构基因和调节基因的差异性表达，差异表达的结构基因受组织特异性表达的调控基因调控73细胞脱分化o脱分化（Dedifferentiation）又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程，即分化的细胞在适当条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程o不同生物的细胞脱分化能力不同，通常采用人工诱导技术诱导体细胞的脱分化不同生物的细胞脱分化能力不同，决定了组织培养再生的难易8o 脱分化后的植物细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团（原始胚样组织），称之为愈伤组织（Callus）。

它具有再分化成为完整植物体的潜能 愈伤组织94 细胞再分化o 再分化（Redifferentiation）是指在离体条件下，无序生长的脱分化的细胞在适当条件下重新进入有序生长和分化状态的过程细胞再分化过程事实上是基因选择性表达与修饰的人工调控过程o 再分化是再生的基础离体培养植物组织或细胞再生植株就是通过细胞脱分化和再分化实现的o 脱分化是细胞全能性表现的前提，再分化是细胞全能性的最终体现10植物人工繁殖：通过无性繁殖实现植物快速繁殖 方法：组织培养、人工种子、胚胎培养目的：为克服自然有性生殖的不足，满足对优良植物的大量需求11二 植物组织培养再生o 植物组织培养（Plant tissue culture）是将植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术o 愈伤组织：指由植物的一种组织或器官经历脱分化形成的原始胚样组织，它具有再分化成为完整植物体的潜能o 外植体（Explant）:主要指用于离体培养的植物或组织切段可以是器官、组织、细胞和原生质体等o 继代培养:愈伤组织在培养基上生长一段时间后营养物枯竭，水分散失，并已经积累一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上。

12植物组织培养的优点13http:/ 脱病毒植株o 很多农作物都带有病毒，尤其是无性繁殖植物，如马铃薯、甘草、草莓、大蒜等病毒积累，危害加重o 植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒因为该区无维管束，病毒难以进入，所以茎尖培养成为获得无病毒植株的重要途径16http:/ 1.快速繁殖：例如一株兰花一年可以繁殖到400万株o 2.种苗脱毒：可以有效地培育出大量的无病毒种苗已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉等o 3.突变育种：可以直接诱变筛选出具抗病、抗盐以及高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种o 4.基因工程育种：基因转导后通过组织培养途径实现植株再生o 5.远缘杂交：利用离体受精技术和组织培养结合可以实现远缘杂交，培育一些罕见的新物种例如苹果与梨的杂交种19植物组织培养技术o 1.生物条件n 外植体（Explant）主要指用于离体培养的植物或组织切段o 因素：n 不同植物品种n 同一品种不同取材部位、发育阶段一般：生长点、幼嫩组织n 大小适中，进行清洗、灭菌，大了容易污染，小了不易成活202.物理条件：o 培养环境、组织培养室n无菌环境，人工控制温度、光照、湿度等培养条件n需要一定的设备、器材和用具。

21223 化学条件：培养基o（1）无机盐n 培养基中无机盐的浓度通常在 25mmol/L左右n 根据添加量分为大量元素（浓度大于0.5mmol/L）和微量元素(浓度低于0.5mmol/L)n 大量元素主要有氮、硫、磷、钾、钙、镁氮、硫、磷是蛋白质、氨基酸、核酸和酶的主要成分n 微量元素主要包括铁、锰、铜、锌、氯、硼、钼等这些微量元素对于蛋白或酶的生物活性十分重要，并参与生物过程的调节23（2）有机物o常用的有机物成分包括糖类、氨基酸、维生素、醇类等n 糖类：是离体培养的植物细胞所必需的，既可以作为碳源，又可以维持渗透压蔗糖或D-葡萄糖是常用碳源n 蔗糖浓度多在310之间，因不同植物材料而异n 一般在诱导培养阶段蔗糖浓度高一些，分化培养时蔗糖浓度低一些n 大多数植物以蔗糖为碳源时生长都较好，少数适合在葡萄糖或果糖为碳源的培养基上生长也有植物利用麦芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇和乳糖作为碳源24o 氨基酸：通常采用蛋白质水解产物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物o 维生素：直接参与酶的合成，还参与蛋白质和脂肪的代谢尽管在培养过程中细胞能合成必需的维生素，但是数量上满足不了需求，需要在培养基中添加。

n常用的维生素：硫胺素（Thiamine,VB1），吡哆醇（Pyridoxin,VB6）、烟酸（Nicotinic acid,Vpp）、生物素（Biotin,VH）、泛酸钙(Ca-pantothenate) 、叶酸(Folic acid)、维生素C等o 肌醇：在糖类的相互转化、维生素和激素利用等方面具有促进作用，并能刺激细胞快速生长o 腺嘌呤：是合成细胞分裂素的前体物质之一添加腺嘌呤能促进细胞合成分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成2）有机物25（3）调节物质 o植物激素(Phytohormone)是植物自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物能影响生长和分化o在个体发育中，不论是种子发芽、营养生长、繁殖器官形成以至整个成熟过程，主要由激素控制n 植物激素的作用机理：植物体内的激素与细胞内某种称为激素受体的蛋白质结合后，影响DNA、RNA和蛋白质的合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表现出调节代谢的功能26生长素（Auxin）o 是由色氨酸通过一系列中间产物形成的o 在植物组织培养中，生长素主要用来刺激细胞分裂和诱导根的分化常用的生长素有：吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。

其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素o 生长素处理植物细胞主要作用于转录系统用生长素处理植物细胞能够刺激mRNA和rRNA的合成以及某些核蛋白的磷酸化 27细胞分裂素（Cytokinin） o 大多是嘌呤族衍生物，自然状态下分裂素主要在根中形成，茎端、萌发中的种子、发育中的果实和种子也能合成分裂素o 分裂素的生理作用主要是诱导芽的分化促进侧芽萌发生长、促进细胞分裂与扩大多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低o 主要有激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（BA）和玉米素（ZT）等其中最常用的是6苄基腺嘌呤o 对于细胞分裂素的作用机理还不清楚 28激素配比o 1956年，米勒（Miller）从鱼精子中分离得到比腺嘌呤活性高的激动素，效果比腺嘌呤好，代替了腺嘌呤而与生长素一起控制器官分化并与斯库格（Skoog）一起提出了植物激素控制器官形成的观点1948年，斯库格等较好地解决了如何从离体组织或器官中诱导植物再生的方法，并确定了腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件：29兰花组织培养o 兰花是第一个组织培养成功产业化的植物o 名贵兰花达摩兰：以禅宗“一花开五叶，结果自然成”的诗意命名。

o 在台湾，早期达摩量少，求种者多，非常昂贵；有人曾以一盆爪艺达摩交换台中市一栋高楼o 珍稀而名贵的达摩兰等名贵兰花，如今已成市井之花一株不过百元30激素配比举例31虽然海藻组织培养成果显著,但是仍然存在许多尚未解决的问题海藻的愈伤组织由于诱导率低、生长缓慢及分化困难,很难像高等植物一样大规模用于养殖育苗和次生代谢产物的生产海藻组织培养32其它一些有激素生理活性的物质，如：甾类、多胺类、水杨酸类等五类植物激素赤霉素：属于二萜类酸，由四环骨架衍生而得赤霉素种类至少38种，广泛应用于农业生产可刺激叶和芽的生长，提高产量最突出的生理效应是促进茎的伸长和诱导长日植物在短日条件下抽薹开花遗传上矮生的植物对赤霉素最敏感33（4）常见培养基o MS培养基：1962年穆拉辛格和斯库格为烟草细胞培养而设计，其中硝酸盐的浓度高，适合植物原生质体、细胞和组织培养o B5培养基：1968年甘伯尔格为大豆细胞培养而设计，铵的浓度低，适合木本植物的组织和细胞培养34培养基分类 o 富盐平衡培养基 是目前使用最广泛的一类，代表性的培养基有MS、LS、BL、BM、ER等特点是：无机盐浓度高，微量元素种类齐全，浓度高；元素间比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲能力、稳定性好、营养丰富，一般培养时无需再加入有机成分。

o 高硝态氮培养基 代表性培养基有B5、N6、SH特点是：硝酸钾浓度高，氨态氮浓度低，含有较高浓度的硫胺素（VB1）o 中盐培养基 代表性培养基有Nitsch、Miller、Blaydes、H大多是在MS培养基基础上进行改良设计特点是：大量元素无机盐为MS的一半，微量元素种类减少、含量增高维生素种类比MS增多，例如增加了生物素、叶酸等o 低盐培养基 代表性培养基有 White、WS、HE、HB特点是：无机盐、有机成分含量浓度低，多用作生根培养的培养基3536与微生物培养基的区别?o 组分复杂，价钱昂贵o 需要大量无机盐o 多种维生素和激素o 一般采用无机氮源o 一般以蔗糖为碳源374 植物组织培养再生植株的途径 o 两条途径完成：o 一是器官发生途径：成熟细胞愈伤组织出根出芽完整植株o 二是体细胞胚发生途径：成熟细胞分生细胞胚状体完整植株 38（1）器官发生途径o 植物的器官发生是指离体培养的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程o 在自然界，许多植物的无性繁殖（如插条、嫁接等）属于器官发生途径的发育方式39过程：o （1）启动期：启动诱导外植体细胞脱分化和分裂n 用于培养的植物组织多是由已经分化成熟的细胞组成，这些细胞大部分已经丧失分裂能力。

由这些细胞诱导产生愈伤组织必须首先使这些细胞恢复分裂能力，变成分生性细胞n 主要通过向培养基中添加一定浓度、种类和比例的外源激素刺激外植体细胞改变原来的代谢途径来诱导细胞活化，重新获得分裂能力，需要选择合适的较高浓度的生长素诱导剂（如NAA、IAA、2，4-D等）或细胞分裂素启动诱导外植体细胞脱分化和分裂。