129生长激素生物活性的测定方法-中国药品检验标准操作规范2010年版.doc

生长激素生物活性的测定方法一、去垂体大白鼠体重法1 实验材料及用具1.1 天平 精度 0.01mg 供试品称量用精度 1mg 试剂称量用精度 0.1g 大鼠称重用1.2 实验用具 手术板、注射器（1ml，精度 0.01ml） 、吸管、移液管、带塞玻璃小瓶、烧杯、玻璃棒、量筒、脱脂棉1.3 手术器械 手术剪、直镊、眼科剪、眼科直镊、眼科弯剪、牙科钻、钻头、抽滤瓶、真空泵、牙科刮勺、止血钳1.4 试剂 氯化钠、牛血清白蛋白、乌拉坦2 溶液配制2.1 生理盐水 称取氯化钠适量，加水配成 0.9%的溶液2.2 牛血清白蛋白的生理盐水溶液，称取牛血清白蛋白适量，加生理盐水配成 0.1%的牛血清白蛋白的生理盐水溶液，简称溶媒2.3 乌拉坦溶液 称取乌拉坦适量，加生理盐水配成 25%的乌拉坦溶液2.4 标准品溶液2.4.1 实验当日，取生长激素标准品，放置至室温2.4.2 割开安瓶（注意勿使内容物损失）立即按标示效价精确加以定量溶媒将全部内容物洗出，使成 1.0IU/ml 的标准品溶液；亦可精密加入适量溶媒使溶解，混合均匀，精密吸取适量，用溶媒配制成 1.0IU/ml 的标准品溶液。

2.5 标准品稀释液2.5.1 按《中国药典》附录生长激素生物检定法的要求，选择标准品高（d S2） 、低（d S1） 2 组剂量及剂距2.5.2 计算 2 组剂量稀释液浓度及大鼠 6 天内皮下注射的总毫升数，一般高浓度稀释液可配成每 1ml 中含 0.10~0.25IU（随季节、动物品系和来源不同） ，低浓度稀释液可配成每 1ml 中含 0.025~0.06IU，高、低两浓度比值 r=1:0.25，每鼠皮下注射每天 0.5ml/次，连续6 天，每组至少 8 只，例如：高浓度稀释液 dS2=0.1IU/ml×0.5ml/（天．鼠）×6 天×8 鼠/组=2.4IU/组，即 0.1IU/ml 高浓度稀释液 24ml低浓度稀释液 dS1=0.025IU/ml×0.5ml/（天．鼠）×6 天×8 鼠/组=0.6IU/组，即 0.025IU/ml 低浓度稀释液 24ml2.5.3 精密量取 1.0IU/ml 标准品溶液适量，置 50ml 烧杯中，加入溶媒适量成标准品dS2 稀释液（如 0.1IU/ml） 2.5.4 同法用 dS2 标准品稀释液（如 0.1IU/ml）配制成低浓度稀释液 dS1 溶液。

2.6 供试品溶液 按生长激素供试品的标示效价或估计效价（A T）配制溶液2.6.1 粉末2.6.1.1 取生长激素粉末，放置至室温2.6.1.2 迅速精密取适量，置带塞玻璃瓶中2.6.1.3 将称量的毫克数，乘以标示单位数，得总单位数2.6.1.4 精确加以定量的溶媒配成 1.0IU/ml 的供试品溶液2.6.1.5 精密量取上述溶液适量，同标准品溶液的释液方法，加溶媒生理盐水配成相应的高（d T2） 、低（d T1）两浓度供试品溶液2.6.2 注射用粉针2.6.2.1 取供试品放置至室温2.6.2.2 割开安瓶（注意勿使内容物损失）立即精确定量加溶媒将全部的内容物洗出，使成 1.0IU/ml 的供试品溶液2.6.2.3 精密量取上述溶液适量，同标准品溶液的释液方法，加溶媒配成相应的高、低两浓度供试品溶液2.6.2.4 将标准品和供试品高、低浓度稀释液按每天剂量分装入带塞玻璃瓶中并密封，置-15℃ 以下保存3 实验动物 同一来源、品系，出生 26~28 天，体重 60~80g，同一性别、健康的大白鼠，试验前 2~3 周无菌条件下，25%乌拉坦溶液（0.3ml/100g 鼠）腹腔注射麻醉，手术摘除脑垂体，迅速缝合，每只鼠编号记录体重，手术后于清洁级以上动物室饲养使其恢复，备用。

4 检查法4.1 准备鼠盒，标明组别4.2 实验当日称量体重，剔除体重变化大于手术后一周时±10%的大白鼠4.3 选择体重合格大白鼠按体重随机分组，每组 8 只，每只鼠编号并记录体重，正常供给饲料及饮水4.4 每天临用时将配好的标准品或供试品稀释液在注射前取出融化，放置至室温4.5 按组别分别给以标准品或供试品高、低 2 种浓度稀释液，每鼠 0.5ml，每天 1 次，连续 6 天，每天应该安排在相同的时间内注射，或分 6 次注射的间隔时间应接近4.6 皮下注射勿使药液溢出，每次注射要调换部位，如第一次给药自一侧颈部皮下进针，第二次，第三次在另一侧或中央进针，将药液注入不同部位，每次注射后清洁鼠盒4.7 最后一次注射后 24!h，按给药次序脱颈处死大鼠4.8 称大鼠体重4.9 对可疑大鼠可进行尸检，切开蝶鞍区，肉眼检查有无垂体残留，剔除有垂体残存的动物5 实验结果计算5.1 计算每只动物反应值（y） ，即体重变化 y=给药后体重-给药前体重5.2 将反应值实验结果按“ 生物检定统计法” （《中国药典》附录Ⅺ V）中的量反应平行线测定随机设计法列表的格式整理5.3 按量反应平行线测定（2.2）法或（2.2.2）法随机设计处理结果。

5.3.1 编制程序，用计算机计算效价、实验误差可靠性测验应通过，本法可信限率FL（%）不得大于 50%5.3.2 计算也可用手算进行可靠性测试，实验结果成立者，进行以下计算计算M、R 、P T、S m、FL、FL%5.4 实验结果中出现的特大、特小等特异反应值，按《中国药典》规定判断其是否可以剔除，个别剂量组缺失的数据，如符合药典附录要求，按所规定的方法补足6 结果判断6.1 生长激素（2.2）法或（2.2.2）法的可靠性测验应为剂间，回归变异项非常显著，偏离平行，二次曲线，反相二次曲线不显著，否则实验结果不成立对实验结果不成立者应做以下检查6.1.1 检查实验操作包括溶液配制，注射，对实验动物的照顾等是否符合本法的实验要求6.1.2 剂间、回归不显著，S、T 或 U 的反应不在对数剂量-反应值线范围内，应根据反应结果，重新调整剂量复试6.1.3 可靠性测验通过，实验结果成立，若试品间变异显著时，可根据 S 和 T 各剂量组的反应情况调整剂量以减小实验误差6.1.4 T 或 U 各剂量组反应值明显高于 S 剂量组时，可调低 T 或 U 的剂量，或提高 T或 U 的估计效价。

6.1.5 T 或 U 各剂量组反应值明显低于 S 剂量组时，可调高 T 或 U 的剂量，或降低 T或 U 的估计效价6.2 实验误差（FL%）的判断按药典规定，FL%超过者，可做以下处理6.2.1 检查动物来源，实验操作，对动物的照顾等是否符合本法的实验要求6.2.2 重复实验6.2.3 按规定将几次实验结果合并计算，求得合并计算的效价及实验误差，应符合规定二、去垂体大白鼠胫骨法本法与去垂体大白鼠体重法的标准品与供试品溶液配制与稀释、检定法和实验结果计算一致，并常与体重法同步进行增加和不同之处有以下1 实验材料及用具1.1 试剂 甲醛、丙酮、硝酸银、硫代硫酸钠、乙醇，其它与体重法相同1.2 实验用具 刀片、载玻片、腊板、带有测微尺的光学显微镜，60W 台灯，其它与体重法相同2 溶液配制2.1 甲醛 称取甲醛适量，加水配成 10%的溶液2.2 硝酸银 称取硝酸银适量，加水配成 2%的溶液2.3 硫代硫酸钠 称取硫代硫酸钠适量，加水配成 10%的溶液2.5 乙醇 量取乙醇适量，加水配成 80%的溶液3 检定法3.1 体重法实验结束后，处死的大鼠取下左右二只后腿。

3.2 剪开皮肤及肌肉，剥离出胫骨并标号3.3 将胫骨从近心端顶部中间沿矢状面切开并置 10%甲醛保存3.4 脱蛋白 将胫骨水洗 10min 后，置丙酮中 10min3.5 染色 将胫骨水洗 3min，置 2%硝酸银中染色 2min3.6 水洗一次后置水中台灯下强光照射至胫骨变棕黑色3.7 固定 将胫骨置 10%硫代硫酸钠中固定 30s3.8 保鲜 将胫骨置 80%乙醇中供测量用3.9 切片 将胫骨沿刨面切 1mm 左右薄片3.10 薄片置光学显微镜下测量胫骨骨骺板宽度作为反应值4 实验结果计算与体重法一致注意事项：1. 动物 取幼年（体重 60~80g）大白鼠，以消除内源性生长激素的干扰；一般用雄性，较为敏感2. 垂体切除术麻醉：25%乌拉坦溶液（一般 0.3ml/100g 鼠重） ，要求浅麻，术后即能苏醒钻孔：大白鼠平躺于大鼠架上，固定 4 肢及嘴部，沿颈部中线近下腭处，用剪刀剪一长约 1~2cm 的切口，将领下腺向左右两侧分开，右侧处皮用止血镊夹住后，向外侧拉开，即可清楚见到覆盖于气管的胸甲状肌，在此肌左侧近咽部处，用眼科弯镊层层分离肌肉直到触及骨板。

然后用小锐匙或用眼科弯镊夹住小棉球除净附着于骨板上的肌肉，在咽部正下方、左右两听囊之间，可触到一“┬”形突起，用小棉球将“┬”形附近及突起部位的肌肉全部擦干净，即可清楚地见到“┬”形突起在横突起上有一条深蓝色横肉线（蝶枕软骨联合） ，在此横线上方 1mm 中间处用探针刺一小凹孔，然后将手钻（用牙科钻头，固定在用过的圆珠笔芯上）固定于此凹孔处，轻轻旋转手钻，避免用力过度和下压，尤其在第一层骨片被钻破后，进行第二层骨片钻孔时，尤需注意当手上感觉孔已钻通，即用一小针进入孔内试探，若无任何阻碍，则进行垂体吸取，钻孔以与横线相切最为理想垂体吸取 将一端与抽气瓶相连的垂体吸取管对准钻孔，开动抽气泵，吸取垂体，待垂体吸出后，用棉球擦干血液，立即将皮肤切口缝合，并给动物编号、称重同一批实验的动物，垂体切除术应在 3 天内完成在切除手术过程中，如动物出现窒息现象，可立即用一玻璃吹管插入动物喉部，有节奏的向气管内吹气，进行抢救环境：要求二级实验室以上并室温在 24~26℃，否则需注射青霉素抗感染饲养：术后大白鼠喂饲标准饲料并饮 5%葡萄糖水至少 3 天剔除：去垂体手术后第 1 周为恢复期，从第 2 周起称重并记录，并每隔 1 天称重 1 次直至给药实验前，及时剔除掉体重变化大于手术后第 2 周的第一天±10%的大白鼠，即选择给药实验前大鼠体重变化小于手术后第 2 周第一天体重±10%的合格健康动物，按体重均匀随机分组。

3. 胫骨法 切片、染色、测量实验条件应一致，用带有测微尺的光学显微镜测量骨骺板宽度起草人：李湛军（中国药品生物制品检定所）复核人：周建平（北京市药品检验所）。