鱼骨胶原蛋白改知识课件知识讲稿.pptx

1罗非鱼鱼骨胶原蛋白分离纯化实验方案课 程名称：微生物指导老师：林莹 教授实验组成员：黄欣欣、林静、颜明月、蔡达、胡丽琴2一、理化性质二、实验器材三、提取分离四、SDS-PAGE目 录：3 物理性质：（1）等电点：在某一pH溶液中表现出不带电荷，呈两性离子状态，即所带正电荷和负电荷相等（零电荷），这一pH称为蛋白质的等电点2）溶解性：胶原蛋白往往出现两个等电点，一个在pH 4.5 5.0；另一个在pH 6.8 8.0，所以胶原蛋白会出现两个最低溶解度胶原蛋白理化性质罗非鱼鱼骨胶原蛋白介绍5罗非鱼骨基本成分 鱼排蛋白质中有80%的胶原蛋白，主要为I型胶原蛋白，II型胶原蛋白可以从软骨中提取得到其中I型至少有两种肽链（ 1和 2）组成，它们的分子大小、亚基构成很相近，含有大量肽链， 1含量接近含量， 1分子量约为130 kDa， 2分子量约为118 kDa， 分子量约为200 kDa成分蛋白质脂肪水分碳水化合物灰分胶原含量（%）37.173.5120.10微量39.2430.976二、分离纯化材料、药品及仪器实验方案7材料、药品及仪器： 新鲜罗非鱼（市售）、乙酸、柠檬酸、氯化钠、EDTA、乙醚、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂、蛋白质标准品、猪胰蛋白酶等(均为分析纯) 电子天平、粉碎机、冷冻干燥机、电热恒温水浴锅、UV 分光光度计、高速冷冻离心机、聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳装置等。

实验流程：鱼排清除残余鱼肉清水清洗晾干脱脂去除盐去除杂蛋白所有过程在10下进行，防止变性提取精制胶原91、鱼骨脱脂工艺 取50g粉碎的鱼骨加入物料比为1:20的乙醚在4下浸泡1d102、鱼骨脱盐去杂工艺 取50g左右脱脂后的鱼骨粉，加入其质量5倍的0.5mol/L EDTA溶液（pH 7.4）于4下浸泡5 d，每天更换一次EDTA溶液，用蒸馏水反复洗涤，再以其质量20倍的 0.1mol/L NaOH溶液4下浸泡12小时，再用蒸馏水冲洗至中性除去非胶原蛋白及防止内源性蛋白酶对胶原蛋白的影响脱钙作用113、胶原的提取 鱼骨经脱盐去杂后，加入等量的0.5mol/L乙酸溶液并在4下浸泡3d，提取液中含有1%的胃蛋白酶，5000r/min离心20分钟去除杂质，收集上清液，即得到胶原粗提液提取过程不断搅拌酸溶性胶原切去末端肽，使三螺旋结构的主体部分溶解在稀酸中124、胶原的精制工艺 粗提液缓慢加入氯化钠粉末，使其终浓度达到0.9 mol/L，盐析过夜，5000r/min离心20分钟，弃去上清液，沉淀用10倍体积0.5mol/L的乙酸溶液溶解，5000r/min离心20分钟去除杂质，上清液再次重复盐析、离心，溶解操作，最后用蒸馏水透析3天，每天更换透析液，冻干即得胶原精制品。

13四、检测方法SDS-PAGE电泳原理：利用SDS这种阴离子去垢剂，SDS带有大量的阴离子，SDS和蛋白质分子结合后形成长柱形的复合物，SDS在外侧，蛋白质分子在内测，从而使得和蛋白质分子的电泳速度唯一有关系的是蛋白质分子量蛋白质浓度：Folin-酚试剂法原理：Folin试剂中的磷钼酸-磷钨酸盐被蛋白质中的色氨酸 和酪氨酸残基还原，发生显色反应：产生蓝色（钨兰+钼兰）蓝色的浓重度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。