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生物奥赛——生物化学,淮北一中生物教研组,第一节 蛋白质(Protein)化学,蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、锌和铜等这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50—55％ 氮 15—17% 铁,锌,锰,钼,碘,铜等 氢 6—8％ 硫 0—4％ 氧 氧 20—23％ 磷 0—1% 其中氮含量较恒定，平均16%一克氮=6.25克蛋白质这是凯氏定氮法的依据一.元素组成,二.基本组成单位——氨基酸,（一）氨基酸的结构通式 或 1.特点：决定了氨基酸有如下特点： ① 具有酸性的羧基和碱性的氨基共同性质 ② α-碳为手性碳原子（R=H） ③ 由于R侧链不同（个性）,,（二）氨基酸的结构,,甘氨酸 Glycine,脂肪族氨基酸,,氨基酸的结构,,脂肪族氨基酸,,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine,氨基酸的结构,,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine,脂肪族氨基酸,,氨基酸的结构,,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine,脂肪族氨基酸,,氨基酸的结构,,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine,脂肪族氨基酸,,氨基酸的结构,,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline,亚氨基酸,,氨基酸的结构,,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline 甲硫氨酸 Methionine,含硫氨基酸,,氨基酸的结构,,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline 甲硫氨酸 Methionine 半胱氨酸 Cysteine,含硫氨基酸,,氨基酸的结构,,芳香族氨基酸,,苯丙氨酸 Phenylalanine,氨基酸的结构,,芳香族氨基酸,,苯丙氨酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine,氨基酸的结构,,芳香族氨基酸,,苯丙氨酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine 色氨酸 Trytophan,氨基酸的结构,,碱性氨基酸,,精氨酸 Arginine,氨基酸的结构,,碱性氨基酸,,精氨酸 Arginine 赖氨酸 Lysine,氨基酸的结构,,碱性氨基酸,,精氨酸 Arginine 赖氨酸 Lysine 组氨酸 Histidine,氨基酸的结构,,天冬氨酸 Aspartate,酸性氨基酸,,氨基酸的结构,,天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate,酸性氨基酸,,氨基酸的结构,,丝氨酸 Serine,含羟基氨基酸,,氨基酸的结构,,丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine,含羟基氨基酸,,氨基酸的结构,,天冬酰胺 Asparagine,含酰胺氨基酸,氨基酸的结构,,天冬酰胺 Asparagine 谷酰胺 Glutamine,含酰胺氨基酸,几种重要的不常见氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。

这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的 其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下氨基酸的等电点,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态三）氨基酸的化学性质,,用途：常用于氨基酸的定性或定量分析2)与茚三酮反应,紫色,注意：脯氨酸与茚三酮反应呈黄色,,1．人体内不能合成而必须从食物获得：（ ） Ａ．嘌呤 Ｂ．嘧啶 Ｃ．果糖 Ｄ．芳香族氨基酸,D,,2．在氨基酸的分类中，下面哪一个氨基酸属于芳香族氨基酸?(1分) A．丙氨酸 B．丝氨酸 C．色氨酸 D．亮氨酸,C,,3．组成蛋白质的氨基酸的α--碳原子是不对称的，但 除外 （ ） A．丙氨酸 B．组氨酸 C．甘氨酸 D．谷氨酸,C,,4．计算天冬氨酸的pI值它的pKl值2．09，pK2值为3．86，pK3值为9．82 ） A．5．26 B．2．98 C．5．96 D．6．84,B,,5．赖氨酸有3个pK值，pKl=2．1；pK2=9．0；pK3=10．5；赖氨酸的pI为 （ ） A．2．2 B．5．55 C．6．3 D．9．75 E．1 0．5,D,,6．当蛋白质溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，蛋白质的 （ ） A．溶解度最大 B．溶解度最小 C．溶解度与溶液pH无关 D．蛋白质变性,B,,7.下列有关Phe-Leu-Ala-Val-Phe-Leu-Lys的叙述，哪项是正确的? (1)是一个六肽 (2)是一个碱性多肽 (3)对脂质表面无亲和力 (4)等电点大于8 A．(1)(2)(3) B．(1)(3) C．(2)(4) D．(4) E．(1)(2)(3)(4),C,三.蛋白质的分子结构（三维空间结构）,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。

氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,（一）一级结构,蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目；多肽链的氨基酸顺序以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础，也是蛋白质高级结构唯一决定因素证据：①蛋白质复性研究 ②人工合成蛋白质,（二）二级结构,蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键 主要有-螺旋、-折叠、-转角-螺旋,-折叠,-转角,主要存在于球状蛋白分子,蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构 维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用，此外，二硫键在维持蛋白质构象上也有重要作用三）三级结构,特点： ①一般为球蛋白，整个分子排列紧密 ②大多数亲水性氨基酸分布在表面，形成亲水的分子外壳，从而使球蛋白溶于水 ③大多数疏水侧链埋藏在内部，形成疏水核,（四）四级结构,两条或两条以上具有三级结构的多肽链组合在一起形成特定构象的蛋白质分子。

四级结构中具有三级结构的多肽链称为亚基亚基单独存在没有活性 作用力：次级键大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收其中主要的是酪氨酸和色氨酸.因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定蛋白质含量,OD值,（一）.蛋白质的紫外吸收,四.蛋白质的性质,计算蛋白质浓度？？？,（二）.蛋白质的双缩脲反应,肽和蛋白质特有，而氨基酸没有 含有两个或两个以上肽键的化合物可以与CuSO4碱性溶液能发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物 可借助分光光度法测定肽或蛋白质的含量,分光光度法原理,（三）.蛋白质的两性离解与等电点,蛋白质与氨基酸一样，能够发生两性离解，也有等电点在等电点时，蛋白质的静电荷为零，在电场中不移动 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动这种现象称为蛋白质电泳电泳示意图,胶体溶液的特点： 分子直径在1-100 nm内 溶于水 不易聚集沉淀 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液,（四）.蛋白质的胶体性质,由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。

蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去 稳定因素： 1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥 2.水膜弹性,（五）.蛋白质的沉淀作用,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等,可逆沉淀,1.盐析法 加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性 2.有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 3.等电点沉淀,,蛋白质脱去水化层而聚集沉淀,盐析（NH4）2SO4）,不可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可再重新溶解于水 于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀,变性,强调：一级结构不变,五 . 蛋白质的分离纯化,（一）.根据溶解度不同,盐析,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,（二）.根据分子大小不同,透析与超过滤 密度梯度离心 凝胶过滤法,1、透析与超过滤 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料,,,,血液透析,小分子被带出,透析机,透析液,加压,血液,,60000~80000转/分 重力60万～80万倍,2、密度梯度离心,3、凝胶过滤法,（三）.根据所带电荷不同,1、电泳,原理： 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 分子大小不同，电场中移动速度也不同,2、离子交换层析,原理： 离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。

带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来六 . 蛋白质中的氨基酸种类的确定,（一）.确定N端氨基酸的方法,Sanger法：2,4-二硝基氟苯（DNFB）在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP） 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸该产物能够用乙醚抽提分离不同的DNP-氨基酸可以用层析法进行鉴定 二硝基氟苯（DNFB）法,自学,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸，原理与FDNB法相同 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9m。