《质粒酶切`鉴定》ppt课件.ppt

质粒酶切、鉴定 及DNA片段的凝胶回收,一. 实验目的,1.了解质粒酶切及电泳鉴定原理 2. 掌握核酸片段的凝胶回收纯化操作技术第一部分,质粒的酶切及电泳鉴定,一. 实验原理,限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA 双链，形成一定长度的DNA 片段 如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： EcoRⅠ：G↓AATTC HindⅢ：A↓AGCTT,限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别用已知分子量的线状DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量酶切反应系统包括：DNA，酶，buffer，灭菌水 注意：不同公司的酶和buffer系统是不同的，所以一个反应应该用同一个公司的酶和buffer 1，DNA：自己制备的DNA，样品中不应该有酚，氯仿，酒精，EDTA，盐离子等的污染，以免影响酶的活性 2，酶：酶量并不是越大越好，酶体积不应该超过总反应体积的1/10。

因为酶是储存在50%甘油中的，而反应体积中甘油的浓度超过5%就会使酶出现星号活性，即切割不应该切的位置) 3，buffer：不同的酶配有不同的buffer，产品目录和酶的使用说明中会说明该酶用哪种buffer， 有些buffer中需要另外添加BSA4，反应体积，通常1到几微克DNA的反应体积可以控制在50到100微升，用20单位的酶来切 5，反应条件，大多数酶都是37度半小时以上 6，双酶切 因为不同的酶需要不同的buffer，所以有两种情况： 1) 两种酶是同样的buffer尽量用同一个公司的酶，这样就跟单酶切操作差不多，可以同时加入两种酶，注意事项是体积和酶量 2) 两种酶是不同的buffer，先用一种buffer离子浓度底的酶切，电泳检测，单酶切开以后，将产物抽提，沉淀，加入离子浓度高的buffer再酶切二. 仪器和试剂,1．主要仪器 （1） 1.5mL塑料离心管 （2）微量加样器10μL、100μL、1 000μL 各一支 （3）台式高速离心机（120 00r/min） （4）水浴锅、电泳仪、电泳槽 2．材料 重组质粒pMD19-b （插入外源基因大小约500bp）,3．试剂 （1）限制性内切酶BamH I、 HindⅢ及缓冲液K ； （2）1×TBE 缓冲液：称取Tris 10.88g、硼酸5.52g 和 EDTA 0.72g，用蒸馏水溶解后，定容至200mL，用 前稀释10 倍。

（3）EB 染色液：终浓度为0.5μg/mL三. 操作步骤,H2O 5.5 μl 质粒DNA(100 ng/μl) 15 μl 10×酶切缓冲液(K buffer) 2.5μl BamHⅠ(5 U/μl) 1μl HindⅢ 1μl,,2. 37 ℃水浴3 h-4h 3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失 活以终止反应，或加入2ul loading buffer终止反应混匀(12000 rpm离心5 sec),1. 反应体系的建立: （25μl体系）,4. DNA 琼脂糖凝胶电泳检测,质粒酶切电泳图,质粒DNA,,酶切图,操作注意事项： 1. 吸样量一定要准确; 2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶; 3. 要求在冰上操作，并充分混匀; 4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染; 5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。

重组所用质粒载体（2.692kb）,,,pMD19载体结构,第二部分,DNA的凝胶回收,传统的DNA回收的方法主要基于降低凝胶的熔点以释放DNA，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收 现多用公司生产的商品化的试剂盒，其原理是采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的NaI）融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂吸附DNA后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA 本次实验采用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司 B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收实验原理,仪器和试剂,1. 仪器： 电泳仪，水浴锅，离心机 2. 材料：酶切的DNA样品 3.试剂：,北京博大泰克生物基因技术有限责任公司生产的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒 Cat.NO.MK005,按凝胶重量：溶胶液=1:3加入溶胶液,,60℃溶胶10min-20min,将溶胶液转移至吸附柱,,12,000rpm离心30s，弃废液,加入500ul漂洗液,,12,000rpm离心2min,弃废液，重复3次,1,2,3,4,5,加入20ul洗脱液，静置5min,吸附柱移至新的1.5ml离心管,,,12,000rpm离心5min,弃洗脱柱，保存样品,DNA酶切条带回收步骤,回收电泳图,,,,约2690bp,,约600bp,DNA片断的连接,实验六,二. 实验原理 (质粒酶切与鉴定 ),DNA片段之间的连接主要是在T4 DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3’羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来,需ATP。

学习核酸片断连接的原理和方法,一. 实验目的,连接酶：把基因连在一起,,1、 连接缓冲液的影响： 1） 20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系； 2）10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应； 3）1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性， 4）25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活 5）0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的 注：含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回 连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引 起ATP分解影响DNA连接反应的因素,2、 连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，低温连接较长的时间可取得较好的连接效果 3、 酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。

4、 DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物， DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L要求线性化的连接产物， DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度仪器和试剂,1. 仪器： 离心机 ， 水浴锅 2. 材料：回收的DNA样品 3.试剂： 1）T4 DNA连接酶 2）10X T4 DNA ligase buffer：Tris-HCl（pH7.6）； MgCl2；DTT；ATP三. 操作步骤,载体DNA（大片段）： 6 μl； 插入片段（小片段）： 2μl； 10× T4 DNA ligase buffer： 1 μl； T4 DNA连接酶： 1 μl,2） 4℃反应过夜（16h）1）连接反应液的制备（10ul体系）：,注意： DNA纯化回收后, 电泳检测应为单一的条带如果切胶过程中不慎带上杂带, 那么回收后电泳结果可能会出现两条以上的带这时可以进行重复纯化回收 2.当连接反应难以进行时，可以适当延长反应时间 当连接效率仍然无所改变时，应当对DNA进行纯化后 再反应 3. 连接反应液可以直接用于转化另外，当转化DNA量 较大或者利用电刺激转化时，先用乙醇沉淀法纯化 DNA。

问 题 思 考 ？,1．核酸片段双酶切与单酶切相比有何优点？进行双酶切操作时应注意些什麽？ 2. 酶切片段的回收与连接时有哪些注意事项。