植物分子育种综述.doc

植物分子育种综述辣椒分子育种研究进展摘要 综述辣椒分子标记育种、转基因育种等方面的主要研究进展,并阐明辣椒分子育种正朝着遗传图谱信息多元化、分子育种技术高效化、分子育种理论系统化的方向发展关键词 辣椒;分子育种;分子标记辅助育种;转基因育种;分子设计育种辣椒是重要蔬菜作物[1 -2]辣椒传统育种方法在提高产量、改善品质、增强抗性等方面具有选择效率低及育种周期长等缺点,因此迫切需要辣椒育种技术的升级换代近年来,分子育种技术在辣椒育种上逐步得到了发展辣椒分子育种包括辣椒分子标记育种、辣椒转基因育种、辣椒品种分子设计育种3个方面辣椒分子育种将使以表型选择为主的传统育种转变为对基因型的直接、准确、高效选择,从而实现育种效率的大幅度提高笔者对辣椒分子标记辅助育种、辣椒转基因育种研究进展进行综述,分析发展趋势,探讨有机整合方式,为我国辣椒分子育种研究的发展提供参考1 辣椒分子标记育种1.1 辣椒分子遗传图谱 随着分子标记的不断发展和图谱研究的不断深入,辣椒图谱的饱和度也在随着增加目前国内外已构建了20余张辣椒分子遗传图谱,根据其来源可将辣椒图谱分为种间杂交和种内杂交图谱1.1.1 种间图谱种间图谱多态性较丰富,适合做高饱合图谱。

Tanksley等利用CA50(C.annuum)@CA4(C. chinense)BC群体和RFLP标记,构建了1张包含19个连锁群、85个RFLP标记的图谱[3]此后,其他的研究者陆续采用各种DNA标记技术,基于越来越大的种间分离群体,使图谱的饱和度不断增加迄今为止,至少报道了6张以上来源于种间杂交的分子遗传图谱,包括来源于C. annuum与C. chinense的种间杂交群体和C.annuum与C. frutescens的种间杂交群体[4]1.1.2种内图谱种内图谱的多态性标记相对较少,但对辣椒育种意义更大辣椒的种内图谱主要来源于C.annuum的种内群体Lefebvre等基于Yolowonder@Perennial的DH群体,构建了1张包括14个连锁群和85个标记、总图距820cm的遗传图谱,平均标记间距9.6 cM,并将4个连锁群同染色体对应[5]Lefebvre等以2个DH群体(H3@Vania, Pe-rennial@Yolowonder)和1个F2群体(Yolowonder@CriollodeMorelos334)构建了3张连锁群分别为20、26、18个的种内遗传图谱,3张图谱分别包括534、594、186个分子标记,图谱的总跨度分别达到了1513、1688、685 cm,平均标记间距13.0、12.5、13.7 cm,完成了6条连锁群与染色体的对应;通过这3张图谱的分析,形成了1个包含100个功能基因标记和5个农艺性状位点的一致性图谱[6]。

张宝玺等基于DH群体,构建了1个包含43个AFLP标记、8个连锁群的图谱[7]Wang等利用123个单株的重组自交系构建了1个包含171个AFLP标记,共13个连锁群,总跨度923.5 cM的辣椒种内遗传图谱[8]曹水良等以辣椒属长椒变种的2个自交系的F2代群体为材料,利用RAPD构建1张含有28个RAPD标记,由11个连锁群组成的辣椒分子连锁图谱[9]1.1.3 图谱整合2004年,以色列、美国和法国的12名研究者整合了6张图谱的信息,共同发表了1张相对完整的辣椒图谱,该图谱包含了6个群体、2262个分子标记,总跨度 832 cm,平均标记间距0. 8 cm,该图谱可望为辣椒的分子标记辅助聚合育种提供重要参考[10]1.2 辣椒重要性状基因的标记和定位1.2.1 辣椒抗病虫基因及与果实性关相关基因辣椒上已经命名的基因有292个[11]辣椒的病虫害比较多近年来辣椒抗病基因的遗传定位发展很快,利用部分抗源材料,抗病毒病、疫病、疮痂病、白粉病及线虫等的基因相继得到了定位辣椒果实相关性状多数是由多基因控制的数量性状,最近对其遗传定位的研究比较多,主要集中在果色、果实大小、果实形状、单果质量、辣味等方面[12]。

1.2.2 辣椒雄性不育基因目前报道的辣椒的雄性不育有2种,一是细胞核雄性不育,另一种是胞质雄性不育Zhang等采用BSA分析F2群体(21号牛角椒@湘潭晚),找到2个稳定重复性好、与辣椒雄性不育恢复主基因连锁的RAPD分子标记,这些标记对主效恢复基因辅助转育有一定帮助[13]Kim等采用RT-PCR技术扩增了辣椒雄性可育系和CMS胞质不育系的线粒体基因atp6,并对编码区及5c、3c端进行了测序[14]张宝玺等将控制辣椒胞质雄性不育恢复性的QTLs初步定位到第1、3、6、8个连锁群上;王立浩等在此基础利用DH分离群体,通过分析育性的分离情况,评价了CMS的遗传规律,得出恢复性受主效基因和4个微效基因控制的结论,并将主效基因定位在P6染色体上[15]唐冬英等2004年通过RAPD-BSA分析法,找到了1个与辣椒细胞质雄性不育恢复系8001中的恢复基因紧密连锁的RAPD标记OPL09-7631.3辣椒分子标记育种实例 分子标记在辣椒重要性状基因定位、育种材料筛选方面取得了显著成绩,但在抗病材料转育和新品种培育方面获得成功的报道还不多Thabuis等利用分子选择的方法将4个抗疫病的QTL从辣椒中转入了甜椒Yolowonder,提高了Yolowonder的疫病抗性,并采用遗传背景的选择,在BC3代已经收到良好的效果[16]。

王立浩等利用CAPS标记,将pvr4基因从/CdM3340向5个自交系770130、75-7-3-10、830770、830780、83-1630中转育,在BC1群体中分别检测出含有抗病连锁标记的单株21、15、10、11、12株,选择的准确率97% ~98%,有4个群体经卡平方检测符合1B1[17]说明分子标记辅助选择不仅提高了国内优良辣椒材料的抗病性,还加快了育种进程王立浩等利用AFLP、SCAR和CAPS标记在辣椒材料Perennial0和Yolowonder0组成的BC2和BC1S1分离世代对抗PVY的3个QTLs位点进行选择BC2群体经过CAPS标记的选择得到了在主效QTL上47个杂合位点的单株,52个纯合位点的单株在47个杂合位点的单株中,检测到25个位于LG9 PY2的含有抗性位点的单株再经过AFLP标记对QTL LG1lP10的选择,只有11株含需要抗病位点的杂合型BC1S1群体经SCAR标记筛选得到55株纯合抗性位点,再经CAPS标记筛选得到12株在主效QTL上纯合抗性位点的单株[18]2 辣椒转基因育种2.1 转基因方法 辣椒遗传转化不仅是鉴定基因功能的重要手段,也是培育辣椒新品种的重要途经之一。

Liu等在1990年首次报道用农杆菌介导对辣椒进行遗传转化的结果,获得了冠瘿瘤[19],但未获得转基因植株华南农业大学雷建军教授领导的课题组在辣椒遗传转化研究方面开展了大量的工作,取得了丰硕的成果[20]随着更多的目的基因被分离出来,转基因辣椒也越来越多辣椒转基因所用的方法包括农杆菌介导法、电激法、花粉管道法、基因枪法等,其中农杆菌介导法应用较多导入的外源基因分为抗病基因、抗虫基因、抗除草剂基因、耐盐基因等2.2 转抗病毒蛋白基因 在抗病基因工程中,抗病毒基因工程进展最快,取得的成果最多,尤其是在通过导入病毒外壳蛋白基因获得抗病毒的转基因植株方面,有很多将病毒外壳蛋白基因导入辣椒的报道Murphy等报道,用电激法转化将辣椒斑驳病毒和CMV病毒外壳蛋白基因转入5个辣椒品种的原生质体,成功获得了转基因辣椒[21]周钟信等、Yu分别将CMVcp基因转辣椒中,结果CMVcp基因都已经整合到辣椒基因组中毕玉平等在构建了TMVcp、CMVcp双价表达载体和建立辣椒高效转化体系的基础上,用农杆菌介导法转化了农大40号0和/湘研l号0,都分别获得了转基因植株[22]李华平等将黄瓜花叶病毒衣壳蛋白(CMVcp)基因用农杆菌介导法转入华椒17号,进行PCR、Northern blot杂交和DAS-ELISA检测[23]。

郭亚华等用CMV和TMV的外壳蛋白基因构建双价载体,获得了抗CMV和TMV的转基因植株商鸿生等用CMV和TMV的cp基因转化了线辣椒优良品种陕82120,并研究了抗卡那霉素和抗黄瓜花叶病毒特性的遗传传递规律董春枝等将CMV卫星RNA互补DNA导入到辣椒,获得了抗病性有所增强的转基因植株[24]2.3 转抗真菌、细菌病基因 辣椒转抗真菌病基因研究相对较少,Kim通过农杆菌将RIP基因转入辣椒获得了14个再生植株,检测证明再生植株都含有该基因,并且都可以遗传[25]目前已知的抗细菌的基因主要有抗菌肽类(CecropinA,B,D等)、溶菌酶类和抗菌蛋白类,其中以昆虫抗菌肽类基因工程研究最多、发展最快张银东等用农杆菌介导法将抗菌肽基因CecropinB、CecropinD导入辣椒品种/雪峰0中,获得了再生植株,经PCR和Southern杂交检测表明目的基因已经整合到辣椒核基因组中[26]李乃坚等则将昆虫抗菌肽B、D基因构建而成的双价质粒pCDBÒ以农杆菌为介导转入到5个辣椒栽培品种(早丰l号、徐椒l号、苏椒2号、农丰4号等),共获得卡那霉素抗性植株1200多株,对部分卡那霉素抗性植株进行点杂交、PCR、Southern杂交检测,结果证明外源基因被成功整合[46]。

盆栽接青枯菌试验结果显示,转基因植株具有较强的抗病力李颖等在获得转抗菌肽基因辣椒后,对后代经过多代定向选育,获得了遗传稳定的抗青枯病的辣椒株系[27]2.4 转抗虫基因 目前应用广泛的抗虫基因主要有Bt基因、CoTÑ(豇豆胰蛋白酶抑制剂基因)和植物凝集素基因等柳建军等将CoTÑ基因转入/益都羊角椒0中,对获得的33株卡那霉素抗性再生植株进行了PCR检测,证明有6棵为转CoTÑ基因植株[28]王朋等也将CoTÑ转入辣椒,经过Southern杂交初步证实该基因已整合到辣椒基因组中袁静等通过农杆菌介导法将杀虫结晶蛋白基因crylAe导入到辣椒子叶外植体中,经卡那霉素筛选、组织化学法检测GUS活性以及PCR、Southern杂交分析,证实crylAe基因已整合到辣椒核基因组中[29]2.5 转抗除草剂、耐盐基因研 辣椒转抗除草剂、耐盐基因研究报道不多, Tsaflaris通过农杆菌LBA4404将带有pat基因的质粒pKBl6.41导入辣椒,试验结果表明,转基因辣椒能够耐受0. 44%浓度的商品除草剂Basta(含20%膦丝菌素),对PPT的耐受能力大大提高林栖凤等利用自花授粉后形成的花粉管通道将海岸耐盐植物红树总DNA导入辣椒,其后代的耐盐性明显增强,在海滩上试种,用海水直接浇灌,约55%的转化株能开花、结果,而对照株全部死亡[30]。

进行蛋白质SDS-PAGE电泳和RAPD分析,分别发现1条1715 kD蛋白质和1条111 kbDNA的特异性谱带,表明通过花粉管通道导入外源DNA是可行的,其后代植株耐盐能力提高与基因组变异有关辣椒转基因育种虽然取得了很大的成绩,但仍有不少问题需要进一步解决辣椒基因型的差异大,有些基因型得不到再生植株辣椒再生过程中,辣椒芽的分化比较容易,但芽的伸长存在一定的困难,转化频率低另外,迄今为止,导入辣椒中的基因主要是病毒外壳蛋白基因,但抗病性不是很强,有些只是病情指数稍低,或者发病时间推迟抗虫基因和其他基因的表达也大同小异 [31] 3 辣椒分子育种发展趋势探讨3.1 辣椒遗传图谱趋于多元化 目前辣椒分子遗传图谱的标记多为RAPD、RFLP、AFLP等标记,标记的种类比较单一应利用高重组率的分离群体,开发一些稳定的、易于操作的标记,如SSR、SNP等标记,以建立标记分布均匀、饱和的分子标记连锁图谱,找到与重要性状基因紧密连锁的分子标记,为分子标记辅助育种和基因克隆服务;通。