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南京中医药大学翰林学院 2014 届本科毕业论文I南京中医药大学翰林学院本科生毕业论文药学系药学 专业 2010 年级学号100201131学生姓名于一丁实习单位盐城苏海制药有限公司论文题目HPLC 测定盐酸多西环素含量及有关物质指导老师吴祥起止时间2014.1.9—2014.6.12014 年 6 月 04 日南京中医药大学翰林学院 2014 届本科毕业论文1HPLCHPLC 测定盐酸多西环素含量及有关物质测定盐酸多西环素含量及有关物质药学 100201131 于一丁 摘摘 要要 目的：测定盐酸多西环素中有关物质的含量方法：HPLC 测定盐酸多西 环素的含量，色谱柱为 Agilent（PLRP-S 柱，8um，250×4.6mm）;以 0.05mol/l 的草酸铵-二甲基二丙醇-0.2mol/l 磷酸 （65:30:5）【10】（用氢氧化钠调节 pH 为 8.0) 做为流动相;柱温：60℃；波长设定：270nm;流速：1ml/min；进样量：20ul；色 谱工作站： ChemStation 色谱数据工作站 结果： （1） 盐酸美他环素的含量≤2.0% （2）盐酸β-多西环素的含量≤2.0%（3）美他环素峰的之前及多西环素峰（主 峰）的后面的任一杂质均不得过 0.5%。

（4）含 C22H24N2O8（多西环素）为 800～ 920(u/mg)【4】关键词 高效液相色谱法；盐酸多西环素；有关物质；含量测定；HPLC DETERMINATION OF DOXYCYCLINEHYDROCHLORIDE CONTENTAND RELATED SUBSTANCESAbstract Objective: To determine the content of related substances hydrochloride doxycycline in. Methods: HPLC determination of the content of doxycycline hydrochloride, column Agilent (PLRP-S column, 8um, 250 × 4.6mm); in 0.05mol / l ammonium oxalate - dimethyl-propanol-0.2mol / l phosphate (65:30:5) (adjusted to pH 8.0 with sodium hydroxide) as the mobile phase; column temperature: 60 ℃; wavelengthsetting:270nm;flowrate:1ml/min;injectionvolume:20ul; chromatography workstation: ChemStation chromatography data workstation. Results: (1) HCl metacycline content ≤ 2.0% (2) of hydrochloric acid β-doxycycline levels ≤ 2.0% (3) and doxycycline peak (peak) back before metacycline peaks either not too impurity 0.5%. (4) Includes C22H24N2O8(doxycycline) should be 800 ~ 920 (u / mg).Key Words High performance liquid chromatography; Doxycycline hydrochloride; Related material; Content determination1.1.前言前言盐酸多西环素又叫长效土霉素，多西环素或者强力霉素。

盐酸多西环素呈粉末状，色泽呈现淡黄色或黄色，味苦无刺激性味道易溶于甲醇或水等极性很大的溶剂，微溶于乙醇当中，但不溶于氯仿这种极性较小的溶剂当中我们生活当中用的盐酸多西环素大多是其盐酸盐，理化性质较上述保持不变，但是作为盐酸盐的盐酸多西环素在水溶液当中的稳定性很不好，当水溶液为强酸性时，1%盐酸多西环素可以有多种解离常数，常见的分别是 3.5,7.7,9.5由此可见，在这种状态下，该物质极易发生氧化反应【1】盐酸多西环素可以用于治疗因革兰阴性杆菌和革兰阳性球菌造成的上呼吸南京中医药大学翰林学院 2014 届本科毕业论文2道感染而导致的其它的炎症，比如常见的扁桃体发炎，淋巴结炎，老年人的慢性支气管炎 当然盐酸多西环素还可用于治疗斑疹， 伤寒， 支气管肺炎等其他炎症在对于治疗霍乱也是有效果的在预防疟疾方面也起到了相当大的作用其药理作用主要是因为盐酸多西环素可以与敏感菌核糖体 30S 亚基的可逆性结合阻止细菌与蛋白质的氨酰 tRNA 结合，使蛋白质合成受阻【2】又因为盐酸多西环素的口服吸收好，其生物利用度高，脂溶性好，渗透组织能力强，可以迅速广泛分布生物体各处等特点，所以就又可用于生物疾病的预防与治疗上。

本次实验方法中采用高效液相作为分析仪器，在种种分析仪器中，高效液相由于其具有高效分离速度，分析速度快，反应灵敏，色谱柱还可以重复利用，流动相的配置选择广泛， 流出组容易整合加上高效液相适用范围宽泛等特点而被分析工作者青睐目前国内外生产的高效液相型号种类有很多，比如著名的有waters，安捷伦，岛津等实习单位所采用的是安捷伦 1260 型号组成高效液相的几个部件分别为高压输压系统，进样系统，色谱柱分离加温系统，紫外氘灯检测器， 后期数据分析处理系统等，依靠先进的分析仪器对药物分析起到了极大的推动作用为了实验方便以及按照药典的要求，在色谱柱的选取上，选择反向色谱柱，反向色谱柱是指一般采用非极性物质作为固定相，如 C18，需要用水做流动相，可以加入甲醇，乙腈这些可以与水互溶的有机溶剂以调节保留时间反向色谱柱的选取主要适用于分离非极性或者是极性较弱的化合物，当然，为了控制样品在分析过程中会出现的解离， 常用缓冲液控制流动相的 pH 值 同样需要注意的是，C18的使用 pH 值通常为 2.5~7.5，pH 太高会使硅胶溶解，pH 太低会使键合的烷基脱落【3】高效液相色谱的应用分析原理主要是当流动相携带这待测组分的混合物流经色谱柱中的固定相时，就会和固定相产生力的作用，这是因为组成混合物的各组分的理化性质不一样造成的， 这样也就与固定相之间发生的力的作用也不一样了，所以在一同进入色谱柱后，在固定相中停滞的时间不相同，导致了先后不同次序的流出。

2.2.仪器与材料仪器与材料 2.12.1 仪器仪器高效液相色谱仪：1260VWD 紫外检测器、1260Bin pump VL 溶剂输送泵、12060TCC 色谱柱恒温箱、1260ALS 自动进样器(Agilent 1260)色谱柱：填料：PLRP-S 柱，8um，250×4.6mm 品牌：Agilent分析天平 Sartorius BT125D（十万分之一级别，北京赛多利斯仪器系统有限公司生产）等南京中医药大学翰林学院 2014 届本科毕业论文32.22.2 药品与试剂药品与试剂美他环素的对照品：大连美仑公司生产的批号为 MB1088-S盐酸多西环素的标准品：上海安谱科学仪器有限公司生产的批号 CDCT-C13084280 盐酸多西环素的供试品：盐城苏海制药生产，批号 1402050012-甲基-2-丙醇，色谱纯；硫酸氢化四丁基铵，化学纯；磷酸氢二钾，分析纯；氢氧化钠，分析纯；乙二胺四乙酸二钠，分析纯1mol/l 氢氧化钠溶液，0.01mol/l 盐酸溶液等 3.3.实验方法实验方法 3.13.1 试液的配制试液的配制3.1.13.1.1 对照品溶液制备对照品溶液制备美他环素的对照品贮备液的制备：取盐酸美他环素的对照品 12.0mg，精密称定，倒入 10ml 的量瓶中，添加 0.01mol/l 的盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀【4】。

对照品的溶液（1） 、 （2）的制备：精密称定称取盐酸多西环素的标准品 12.0mg，倒入 10ml 量瓶当中再添加 0.01mol/l 的盐酸溶液 6ml，振摇 5 分钟或直接再用上述稀释液稀释至刻度，摇匀，平行制备两份对照品溶液的（3）的制备：精密移取 2ml 对照品的溶液（1）和 2ml 美他环素的对照品的贮备液，放在同一个 100ml 的量瓶中在添加 0.01mol/l 的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀【5】系统适用性的试液的制备： 取盐酸多西环素的标准品 60mg， 置 10ml 量瓶中，加 0.01mol/l 的盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密移取 5ml，置 25ml 烧杯中， 水浴加热 60 分钟， 放在电炉上蒸发至近干 （不得将残渣烧焦） ， 再用 0.01mol/l的盐酸溶液溶解并稀释至 25ml，摇匀，即得【5】3.1.23.1.2 供试品溶液的制备供试品溶液的制备精密称定盐酸多西环素样品大约 120mg，放置在 100ml 的量瓶中在用0.01mol/l 的盐酸溶液使之溶解并稀释至刻度，摇匀，用 0.5um 滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，平行制备两份【5】 3.23.2 色谱条件与系统适应性实验色谱条件与系统适应性实验3.2.13.2.1 色谱及检测条件色谱及检测条件色谱柱：填料：PLRP-S 柱，8um，250×4.6mm 品牌：Agilent流动相：称取 2.72g 的磷酸二氢钾, 0.74g 的氢氧化钠, 0.50g 的硫酸氢化四丁基胺,0.40g 的乙二胺四乙酸二钠，置同一个 1000ml 量瓶中,加 850ml 的水振摇溶解后，再用水将 60g 的 2-甲基-2-丙醇转移至上述 1000ml 量瓶中并稀释至刻度，摇匀，用 1mol/l 氢氧化钠溶液将其 pH 值调节至 8.0±0.1【6】。

南京中医药大学翰林学院 2014 届本科毕业论文4平衡时间：至少 1 小时，基线稳定流速：1ml/min柱温：60℃进 样 量：20ul检测波长：270nm色谱工作站：ChemStation 色谱数据工作站3.2.23.2.2 系统适应性实验系统适应性实验取系统适用性的试液和对照品的溶液（1）分别进样，应符合下列要求：（1）4-表多西环素峰的相对峰的保留时间约为 4（为主降解产物） 、美他环素的峰相对峰的的保留时间约为 6、β-多西环素的相对峰保留时间约为 7、多西环素的相对峰的保留时间为约 9【6】 （图 1）（2）4-表多西环素和多西环素峰的分离度应不得低于 3.0【7】3）对照品的溶液（1）连续进样 5 次所记录色谱图中，按多西环素峰面积计算其标准相对偏差应不得过 2.0% （图 2）1.4-表多西环素 2.美他环素 3.β-多西环素 4.多西环素图 1系统适用性试液分离度 R=2（tR2-tR1）/(W1+W2)=2（8.969-4.287）/(0.6481+0.5730)=7.7>3.0符合规定南京中医药大学翰林学院 2014 届本科毕业论文5对照品（1） 连续的进样次序峰面积12.38E+04 22.39E+04 32.39E+04 42.39E+04 52.39E+04图 2 对照品溶液（1）连续进样 5 次所记录色谱图的峰面积通过计算平均值为 23878.26，标准偏差为 29.59058972 则标准相对偏差为0.12%。

RSD 为 0.12%<2.0%，符合规定3.2.33.2.3 多西环素线性试验多西环素线性试验精密吸取对照品溶液（1）适量，制备成多西环素的浓度分别为 24；48；72；96；120；144ug/ml 的对照品品溶液，再精密吸取上述溶液各 20ul 进入高效液相中， 测得峰面积分别是 892166， 1788346， 2682667， 3577572， 4465894， 5366160以多西环素的样品量浓度（ug/ml）作为横坐标，所测得的峰面积作为纵。