色谱柱选择与维护..ppt

色谱柱的选择与维护 魏少勇 paul@ 15920467889,广州菲罗门科学仪器有限公司,,色谱柱的选择与维护,公司简介 如何选择色谱柱 A、固定相的选择 B、PH的选择 如何维护色谱柱,广州菲罗门科学仪器有限公司,中国全权总代理,广州菲罗门科学仪器有限公司,广州菲罗门科学仪器有限公司,我们的宗旨: 以最真诚和迅速的态度替用户提供优质服务,解决分析的问题和需要,1982 成立于美国加州,提供一系列非常完整的色谱柱,极少数专门提供色谱耗材公司-液相和气相,免费提供超过10000应用谱图,免费提供技术支持,免费提供技术资料,2004 Labvision HPLC Column Report,2004年一月到六月Labvision调查美国1200实验室结果,使用柱子数量的比例 Phenomenex 25% W 22.5% A 7.7% S 7.6% 其他 5% 以下,如何选择适当的色谱柱,,理想的柱子,可以适用于分析所有的化合物,永远不会坏 理想分离度,决定峰分离度的三个要素,,峰保留时间,,,,选择性(出峰的顺序),柱效,如何得到最理想的分析结果,,流动相,被分析物,和固定相三者之间的作用影响峰保留时间和峰分离性.峰保留时间短一般峰型较好,但分离可能不理想.所以为了调节最理想的分析结果,可以改变下列的一项或数项条件: 流动相 固定相 pH 温度,固定相的选择,,疏水性的选择,极性的选择,苯基的选择,固定相疏水性考虑的要素,键合相的种类 (C18, C8, Phenyl, etc),表面积,键合相的键合率,Luna™ C18(2) – 月神,品质可靠,世界畅销的 C18 柱,重复性高 – 可以同时提供 3个不同的批次的柱子,Luna™ C18(2),,,Ginseng Root Column: Luna 5 µm C18 / ODS (2) Dimensions:150 x 4.6 mm ID Elution Type:Gradient Eluent A: Acetonitrile/water (15:85) Eluent B: Acetonitrile/water (80:20) Flow Rate:1.5 mL/min Temperature:25 °C Detection: UV-Vis Abs. – Variable Wave. @ 205 nm,App ID 1125,Luna™ C8(2) & C5,减少疏水性化合物的保留时间,减少分析的时间,Synergi™ Max-RP,疏水性和 C18柱类似 – 但这是一支C12柱,提供比C18柱更尖的柱峰,尤其是分析碱性化合物,Synergi™ Max-RP,Basic Drugs at Neutral pH,疏水性的比较,,C18 phases,,C8 phase,,300Å C18 phase,极性选择性的考虑,首先考虑 固定相的极性封尾,封端基团 分析物的极性官能基 之间的作用,极性选择性,如何增加极性的选择性 极性基团封端 极性基团镶嵌 苯基,极性选择性,Columns: Luna™ 5m C18(2) YMC-Pack™ 5m Pro C18 Synergi™ 4m Polar-RP® (Ether-linked Phenyl) 150x4.6mm Mobile phase: 75:25 Methanol:water Flow rate: 1 mL/min Components: 1. Estrone 2. Estradiol,极性选择性,Synergi Max-RP - C12 Synergi Hydro-RP - C18 Synergi Fusion-RP – C18 Synergi Polar-RP – Phenyl,Synergi™,Silica Advantage Balancing Efficiency & Backpressure,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Linear Velocity (mm/sec),Plate Height (H),5µ,4µ,3µ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Flow Rate (mL/min),Pressure Drop (Bar),,,higher efficiencies,lower backpressures,Synergi™,Synergi™,Synergi™ Max-RP,与C18柱性能类似的C12柱,Synergi™ Polar-RP®,保留极性和苯基化合物,100% 水溶液稳定,增加极性的选择性,Synergi™ Hydro-RP,疏水性非常强,极性封端100%水溶性稳定,增进极性的选择性,Synergi Hydro-RP VS. Luna® C18(2),Synergi™ Hydro-RP,Synergi Hydro-RP,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Synergi Max-RP,Mobile Phase: A: 20mM KH2PO4, pH 4.6 B: Acetonitrile Gradient: A/B (95:5) to A/B (65:35) in 15 min Flow rate: 1.5 mL/min Sample: 1. Morphine 2. Hydromorphone 3. Codeine 4. Nalorphine 5. Oxycodone,Synergi™ Hydro-RP,Synergi™ Fusion-RP,增加极性的选择性同时减少疏水性的分析时间,在水溶液中100%稳定 在LC-MS下面基本无流失,Running Conditions,Mobile phase: 75:25 20mM Potassium phosphate pH 2.5: Acetonitrile Flow rate: 1.5 ml/min Temperature: Ambient Detection: 210nm Injection: 1. Maleic acid 2. Chlorpheniramine 3. Triprolidine 4. Diphenhydramine,Synergi Fusion-RP 4 80Å,一般的 C18柱,,极性增大,疏水性减少,,苯基的选择性影响,被分析物和固定相之间产生的作用,Luna™ Phenyl-Hexyl,使用甲醇可以增加作用效果,Luna™ Phenyl-Hexyl,具有疏水性和苯基双重的选择性,重复性高和稳定的苯基固定相,Luna™ Phenyl-Hexyl,,,Green Tea(绿茶) Column: Luna™ 5u Phenyl-Hexyl Dimensions: 250x 4.6mm Mobile Phase A:0.2% Acetic acid in Water/Acetonitrile (91:9) B:Water/Acetonitrile (20:80) Gradient: 100%A to t=25min, (68:32) t=25min to t=35min, hold 100%B for 10 min. Flow Rate: 1ml/min Temperature: 350C,App ID 14436,苯基的影响,Columns: Luna™ 5m C18(2) 150x4.6mm Luna™5m Phenyl-Hexyl 150x4.6mm Synergi™ 4mm Polar-RP150x4.6mm Mobile phase: 50:50 Acetonitrile:20mM Potassium phosphate pH 2.5 Flow rate: 1.0 mL/min Components: Acidic, aromatic compounds 1. Indoprofen 2. Ethyl paraben 3. Naproxen 4. Diflunisal 5. Indomethacin 6. Ibuprofen,C18(2) Phenyl-Hexyl Polar-RP,,,,,,,,,苯基的影响,pH的影响,当选择流动相的pH时,我们必需考虑到pH对分析物和柱子两者的影响,pH对柱子的影响,即使键合完美,封端完好,硅胶表面还是会存在Si-O-H的微酸游离基 pKa~3.5,如果流动相的pH是4以上,此 Si-O-H的游离基会脱氢, 成为带负电的Si-O-(这会造成和分析物之间的极性反应,而造成峰拖尾),如果流动相的pH是8(或10)以上,硅胶会被破坏,造成柱子损害,pH对分析物的影响,基本上,反相柱的峰保留时间长短,主要归因于疏水性的非极性反应.所以要增长峰保留时间,必需选择流动相的pH能够让分析物保持中性,对酸性分析物(pKa~3-6),基本选择pH在 pKa以下,对碱性分析物(pKa~9-11),基本选择pH在 pKa以上,对碱性分析物的分析建议,多数硅胶柱没法于高pH条件下稳定,所以一般分析碱性化合物时,会选择于pH~1.5-3下进行分析.在此pH条件下,硅胶表面的游离Si-O-H会保持中性,减少离子间的二极反应,因而减少峰拖尾,峰型较好,但是在低pH条件下,碱性化合物的极性增加,疏水性减少,如果要增加峰保留时间,流动相的有机溶剂比率必需减少,对碱性分析物的分析建议,在高pH条件下,碱性化合物可以保持中性,疏水性因而增加,但是如果峰保留时间太长,可以将流动相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间.增加选择分析条件的弹性,流动相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间外,并可以增进峰型(尖),但是问题是:如何在高pH (8以上)条件下分析?,高pH对碱性分析物的分析选择,使用高分子柱,使用最新技术突破的 双子星柱(GEMINI),Gemini™ C18 – 双子星柱,Gemini™ C18 – 双子星柱,在pH 1-12范围内很稳定,适用于酸,中,碱性化合物,特别是 分析中,碱性化合物很理想,可以更有弹性的调节pH以得到合适的分析条件,Particle Technology,Polymer Silica Twin,Gemini™ C18,流动相pH的影响,pH 1 – 12 Stability,Gemini™ C18,,pKa,pKa,总结,将固定相和被分析物之间的疏水性,极性,和苯基关系密切考虑以选择适当的柱子和分析pH范围,,,C18 phase,Phenyl phase,,,,固定相的影响,Hydrophobicity Ranking,,Phase Description & Column Fingerprint,,Sorbent Characteristics & Application Use,,选择柱子的绝佳参考资料,方法开发的绝佳参考资料,如何保护柱子和延长柱子的壽命,使用保护柱,柱子使用完后,立刻冲洗,样品前处理-过滤,固态萃取,尽可能每一种分析方法使用一支专门柱,5% 原理 – C18 柱的基本冲洗方法,使用柱体积10倍的以下溶液冲洗,以0.1-0.2ml/min流速 95/5 = 水:乙晴 5/95=水:乙晴 梯度冲洗-于分析结束后由5%乙晴增加到95%乙晴,保护柱套和柱芯,为何要使用保护柱,将样品中的颗粒和死吸附的 杂质拦截以保护昂贵的分析柱,可以增加柱子的寿命和保持柱效,一般的保护柱有何缺点,增加系统的死体积,峰变宽,保留时间改变,我们的保护柱套有何不同,通用-适用于所有的柱子,直接与柱子连接几乎体积同时不改变峰保留,绝对不与流动相作用,使用容易,价格合理,,SecurityGuard 适用于任何柱子,接头通用,使用容易,不会改变保留时间,。