基因工程第三组核算的提取.ppt

核酸的提取,第三组：王诺菡 朱猛 黄伟男 于大伟 刘芳军 马强 张博 熊建云 杨帆 李志宽,提纲,前言 DNA提取 DNA提取的原则 DNA提取的方法 RNA提取 RNA提取相关知识 RNA提取方法及注意事项 DNA 和RNA提取常见问题分析 核酸提取方法在不同材料中的改进,前言,核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的染色体DNA、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子； 大多数生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3＇端带有polyA结构DNA提取,DNA提取的原则 保证DNA一级结构的完整性 完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求 排除其它分子的污染 RNA、蛋白质、多糖等,DNA纯化要求,核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然.,DNA提取的方法,基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法,基因组DNA提取主要方法,CTAB法 适用于植物组织，真菌等 SDS法 适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等,CTAB法(植物DNA提取经典法),原理 CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。

该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶 的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等 杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃基因组DNA－ CTAB法,TrisHC（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg 2+ 或Mn 2+ 离子抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,CTAB提取缓冲液的经典配方,基因组DNA－ CTAB法,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖CTAB法流程图,植物材料,,液氮研磨,,细胞裂解,,,,裂解液,,,抽提,上层溶液,,,,酒精沉淀,,离心洗涤,干燥溶解,,,,,DNA溶 液,SDS法,原理 SDS 阴离子去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。

用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂 溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 对DNase、RNase有一定的抑制作用 高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴） 使蛋白质及多糖杂质沉淀 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提 乙醇沉淀水相中的DNA,SDS提取缓冲液的配方,TrisHCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg 2+ 或Mn 2+ 离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；,SDS法流程图,动物组织细胞,,组织匀浆,,细胞裂解,,,,裂解液,,,抽提,上层溶液,,,,酒精沉淀,,离心洗涤,干燥溶解,,,,,DNA溶 液,基因组DNA－其它裂解方法,根据细胞裂解方式的不同有： 物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融 化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解 生物方式：酶法,基因组DNA纯化的方法,吸附材料结合法：,质粒DNA提取,碱裂解法 煮沸法,碱裂解法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。

碱裂解法流程图,对数期菌体,,溶液I充分重悬,,溶液II裂解,,,,上清液,,,抽提,上层溶液,,,,酒精沉淀,,离心洗涤,干燥溶解,,,,,DNA溶 液,,溶液III中和,细胞器D NA提 取,线粒体 叶绿体,差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离DNA提取基本步骤,基因组DNA • 新鲜材料，低温保存 • 血液基因组DNA提 取选择有核细胞 • 细胞培养时间不能过长 • 含病毒的液体材料提取前先富集,质粒DNA • 对数期的菌体 • 培养时应加入筛选压力 • 低拷贝或大质粒，应加大菌体用量 • 菌株不要频繁转接（质粒丢失）,材料准备 细胞裂解 核酸分离 纯化,核酸溶解保存,,核酸沉淀,,基因组DNA • 材料过多影响裂解，导致DNA量 少，纯度低 • 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： – 植物材料－－液氮研磨 – 动物组织－－匀浆或液氮研磨 – 组培细胞－－蛋白酶K – 细 菌－－溶菌酶破壁 – 酵 母－－破壁酶或玻璃珠,质粒DNA • 菌体量适当，除净培养基 • 变性的时间不要过长（5分钟） • 控制复性时间，避免基因组D NA的 污染 • G＋菌、酵母细胞酶或机械处理,材料准备 细胞裂解 核酸分离 纯化,核酸溶解保存,,DNA提取基本步骤,核酸沉淀,,DNA提取基本步骤,• 采用吸附材料吸附分离DNA， 应提供相应的缓冲体系 • 采用有机溶剂（酚/氯 仿）抽提时应充分而轻柔的混匀 • 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 • 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,材料准备 细胞裂解 核酸分离 纯化,核酸溶解保存,,核酸沉淀,,DNA提取基本步骤,• 蛋白质的去除： – 酚/氯仿抽提 – 使用变性剂（SDS、 异硫氰酸胍等） – 蛋白酶处理,材料准备 细胞裂解 核酸分离 纯化,核酸溶解保存,,核酸沉淀,,DNA提取基本步骤,• 多糖的去除： – 多糖水解酶 – 在提取缓冲液中加1/2体 积氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。

– 用PEG8000代 替乙醇沉淀DNA： 在500μ LDNA液 中加入200μl 20%PEG8000 (含1.2MNaCl) ，冰浴20min材料准备 细胞裂解 核酸分离 纯化,核酸溶解保存,,核酸沉淀,,DNA提取基本步骤,• 多酚的去除： – 加入还原剂：β巯 基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 – 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG， 可防止酚类与DNA的 结合 • 盐离子的去除： – 70％的乙醇洗涤,材料准备 细胞裂解 核酸分离 纯化,核酸沉淀 核酸溶解保存,,,DNA提取基本步骤,• 预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀 • 加入1/10体 积的NaAc（pH5.2，3M）更 充分沉淀 • 晾干DNA，让乙醇充分挥发,材料准备 细胞裂解 核酸分离 纯化,核酸溶解保存,,若长期储存建议使用T E缓冲液溶解 pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,核酸沉淀,分离核酸注意事项,温度不要过高，高温如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用 控制PH范围（PH4到10） 保持一定离子强度 减少物理因素对核酸的机械剪切力 防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构 所用器械和一些试剂需要高温灭菌，提取缓冲液中需加入核酸酶抑制剂,RNA提取及常见问题分析,RNA提取及常见问题分析,RNA提取相关知识 RNA提取方法及注意事项 RNA提取常见问题分析,细胞中RNA的含量,107 个细胞 10µg 30mg动物组织 30­100mg植物组织 rRNA 占80-85% mRNA占1­5%,,,,mRNA的应用,RT­PCR, Northern杂交,cDNA文库构建 mRNA末端快速扩增(RACE),差异表达(DDRT­ PCR),引物延伸反应,体外转录RNA标记,RNA 酶保护试验,RNA微注射(RNA Microinjection),RNA的不稳定性,内因:核糖残基的2’和3’位置带有羟基,易 被水解 外因:内源、外源RNA酶含量丰富,加热后仍 能够正确折叠恢复活性,不易失活,提取RNA的注意事项,经常更换新手套。

皮肤和实验室用品上可能有 RNase,会导致RNase污染 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4­10小时,再灭菌 玻璃器皿可在180℃烘烤4小时 塑料制品和枪头避免交叉污染,常用的RNA酶抑制剂,焦碳酸二乙酯(DEPC ) 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 异硫氰酸胍 目前是最有效的RNA酶抑制剂,裂解组织的同时也使RNA酶失活常用的RNA酶抑制剂,RNasin 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白可以和多种RNA酶结合,使其失活 氧钒核糖核苷复合物 由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性 SDS、尿素、硅藻土等,RNA提取流程示意图,研磨或匀浆,动植物材料,,,细胞裂解,,,,加入裂解液 (TRNzol),氯仿,离心,水相,有机相,,PH 5.7,,,RNA,基因组DNA,纯化,RNA提取流程示意图,,等体积异丙醇沉淀 70%乙醇洗涤沉淀 晾干溶解,RNA吸附柱 去蛋白液 漂洗 洗脱,传统方法:有机溶剂抽提,得率高,柱纯化法:纯度高,无有机溶剂,,水相 RNA,,,,,,RNA提取基本步骤,,材料准备 TRNzol 裂解细胞 加入氯仿抽提 RNA沉淀 柱纯化 RNA溶解 保存,植物组织选取杂质少生长较快的幼 嫩部 培养细胞除尽培养液 消化系统的组织选取杂质少的部位 细菌和酵母需要破壁处理 样品切成小块投入液氮或专门的 RNA样品储存液中保存 液氮研磨时不要使液氮挥发净,RNA提取基本步骤,异硫氰酸胍、酚 (TRNzol) 裂解细胞灭活RNase TRNzol要与细胞组织充分接触 裂解尽量充分,,,材料准备 TRNzol 裂解细胞 加入氯仿抽提 RNA沉淀 柱纯化 RNA溶解 保存,RNA提取基本步骤,,材料准备 TRNzol 裂解细胞 加入氯仿抽提 RNA沉淀 柱纯化 RNA溶解 保存,氯仿抽提时充分混匀 离心分离两相,保证一定的转速和时 间,使蛋白质、多糖和DNA分布到有 机相和中间层,RNA留在水相中 注意避免吸入中间层 不慎吸入再次用有机溶剂抽提,RNA提取基本步骤,,材料准备 TRNzol 裂解细胞 加入氯仿抽提 RNA沉淀 柱纯化 RNA溶解 保存,异丙醇低温沉淀RNA 高盐低pH值,核酸与硅胶膜结合 70%乙醇洗涤,晾干 用经DEPC处理过的水或专门的试 剂来洗脱或溶解RNA -70℃分装保存或加入RNase抑 制剂(RNAsafe),DNA 和RNA提取常见问题 及注意事项,问题一：DNA降解,1. 材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老 2. 提取操作过于剧 烈，DNA被打断 3. 外源核酸酶污染,1.低温保存，避免反复冻融。

2.液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液 3. 增加裂解液中螯合剂的含量 4. 细胞裂解后操作应尽量轻柔 5. 试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 6. DNA分 装保存于缓冲液，避免反复冻融,问题二： D。