食品理化检验霉菌毒素检验汇编.ppt

霉菌毒素的检验,掌握： 黄曲霉毒素的理化性质和薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1的原理和方法 微柱筛选法测定AFTB1的原理及方法 赭曲霉毒素的理化性质和薄层色谱法测定的原理及方法,熟悉： 展青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、玉米赤霉烯酮的测定方法 了解： 霉菌毒素的命名、分类、危害和污染来源,概述 黄曲霉毒素的检验 赭zhě曲霉毒素 展青霉素 脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇 T-2毒素 玉米赤霉烯酮的测定方法,目录,霉菌及霉菌毒素,霉菌：是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌“，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体常见毒性大的霉菌毒素：黄曲霉毒素（AFT）、杂色曲霉素、赭曲霉毒素、伏马菌素、展青霉素、桔青霉素、玉米赤霉烯酮,霉菌毒素的命名与分类,按照产生毒素的霉菌名称来命名,按毒作用部位分,肝脏毒素 肾脏毒素 神经毒素 类似性激素作用物质,,按毒素来源分,曲霉毒素 青霉毒素 镰刀菌毒素,,霉菌毒素的分类,按毒作用机理,抑制蛋白质合成类 作用于离子通道类 作用于细胞骨架类 作用于细胞突触类,,,霉菌毒素的分类,按毒素结构分,二呋喃环 内酯环 醌类,,霉菌毒素的产生条件,水分 pH 温度 湿度 氧气,霉菌毒性与危害,肝、肾、神经、生殖、消化系统的损害 免疫抑制、细胞毒性 致癌、致畸、致突变，如黄曲霉毒素能诱发人、猴、鼠、禽类发生肝癌，致癌所需时间最短为24周。

第二节 黄曲霉毒素的检验,黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT),黄曲霉、寄生霉和温特霉的代谢产物 剧毒物，其毒性是氰化钾的10倍，为砒霜的68倍，是目前发现的最强的化学致癌物质之一 黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强 高温高湿地区生产的花生、玉米、大米、棉籽等最容易被污染,基本结构：二呋喃环和香豆素,产生荧光颜色不同，可分为B族（蓝色）和G族（绿色）两大类及其衍生物,,主要存在于牛奶中,,,AFTB1及其衍生物,,,,,,,AFTG2及其衍生物,,,,黄曲霉毒素的理化性质,耐热，高于280℃裂解；耐光，不耐氧化剂 难溶于水，乙醚、石油醚，易溶于甲醇和氯仿 在碱性条件下，其结构中的内脂环可被破坏形成香豆素钠盐，该盐能溶于水，无毒 在酸性条件下，能发生逆反应，恢复其毒性其反应式为：,黄曲霉毒素B1,黄曲霉毒素的分析方法,TLC 酶联免疫吸附法（ELISA） 微柱筛选法 HPLC,,国标法,薄层色谱法—单向展开法,样品中AFTB1经甲醇-水溶液提取后，浓缩、定容、点样于硅胶G薄层板上，经展开分离后，在波长365nm紫外光下观察蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准比较来确定含量。

样品处理,样品→加正己烷（或石油醚）和甲醇-水溶液，震荡→分层，取甲醇-水层→氯仿萃取→无水Na2SO4→过滤→滤液蒸干→苯-乙腈溶解→备用,点样,在距薄层板下端的2cm基线上用微量注射器滴加样液，标液，一块板滴加4 个点，点的直径～3mm，大小一致，在一条直线上滴加样式如下： 第一点 第二点 第三点 第四点 样液 — 20 20 20 μl 淡标 (0.04 μg/ml) 10 — 10 — μl 浓标 (0.2 μg/ml) — — — 10 μl （最低荧光点） （样点） （荧光定位）,预展及展开,,预展，12cm,展开10～12cm,,观察及确证,365nm,若Rf=0.6附近有蓝紫色荧光,,确证,点样后，在点样处滴加三氟乙酸,,Rf=0.1附近有蓝紫色荧光,展开、紫外灯下观察,,AFTB1→AFTB2a 极性增大,确证点样操作,第一点 第二点 第三点 第四点 样液μl — 20 — 20 淡标（0.04 μg/ml） 10 — 10 — 三氟乙酸 1小滴 １小滴 — — （反应5min ，热风吹2min ，40℃）,,定量操作方法,第一点 第二点 第三点 第四点 样液 — 10 15 20 μl 淡标 10 — — — μl,0.0004μg,（0.04 μg/ml）,定量操作方法,如样点的荧光强度与淡标点的荧光强度一致，则样品中AFTB1含量为0.0004μg 如样点的荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升，直至样点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致。

高效液相色谱法测定AFTB1,样品中的黄曲霉毒素经C18柱分离，用带荧光检测器的高效液相色谱仪检测，以保留时间定性，峰面积或峰高定量样品提取,样品粉碎 加少量水 氯仿提取 无水Na2SO4脱水 过滤 提取液，待净化,,,,,,样品净化和衍生物反应,硅镁型吸附剂,,,1.提取液 2.氯仿-正己烷 氯仿-甲醇 3.丙酮-水洗脱,洗脱液水浴蒸干 氯仿溶解 部分加入正己烷、三氟乙酸 静置30min 氮气吹干 用流动相溶解 进高效液相色谱仪,,,,,,,高效液相测定参考条件,检测器：荧光检测器 激发波长：360nm 发射波长：425nm 色谱柱：C18 流动相：甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾（1+1 ） 或乙腈-甲醇-水（50+150+300） 流速：1.3ml/min,微柱筛选法P130,样液中黄曲霉毒素被微柱管内硅镁型吸附剂层吸附后,在365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环，其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的浓度范围内成正比例关系由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2, 所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量GB/T 5009.23-2006,玻璃微柱管： 内径0.4cm，长12cm, 为便于加液可在管的上部接一段粗的管口。

微柱层析架： 附有接受洗脱废液的容器，要尽可能密闭下层甲醇水提取液,花生油,振摇,,,石油醚 甲醇-水,氯仿,,下层,弃去水层，洗去残留甲醇,,,过滤,备用,,无水硫酸钠,水,黄曲霉毒素的提取—甲醇-水-石油醚提取法,下层萃取液,玉米磨碎,润湿,,,氯仿,过滤,备用,,无水硫酸钠,黄曲霉毒素的提取—三氯甲烷水提取法,甲醇-水,,微柱管制备,脱脂棉（铺顶层） 3cm 无水硫酸钠（60～100目） 1.5cm酸性氧化铝 1～2.5cm中性氧化铝 0.5cm无水硫酸钠 0.5cm硅镁型吸附剂 0.5cm无水硫酸钠 脱脂棉（作底层）,,微柱层析,1ml液体,样液,0.0025μg/ml标液,0.005μg/ml标液,氯仿,展开剂：丙酮－三氯甲烷 （1:9）,,,,结果观察与评定,365nm紫外光照射 若样品柱管内硅镁型吸附剂层只现微黄色荧光环，则样品中黄曲霉毒素含量为未检出(在5或10μg／kg以下)； 若出现蓝紫色荧光环，则需进一步通过薄层色谱测定法进行测定确证时，不需重新提取样品 其操作如下 ： 准确吸取原三氯甲烷提取液于小蒸发皿内挥干， 以少量苯－乙腈混合液(98＋2)分数次转入刻度小管中， 定容至1.0mL，密塞，混匀，按薄层层析法确证， 并测定黄曲霉毒素B1 、B2 、G1、G2 的含量。

需要说明之处,层析用的氧化铝、硅镁型吸附剂及无水硫酸钠使用前应在120℃活化2 h， 装瓶盖严于干燥器内，可保存1周左右， 超过1周需再次活化 层析结束后，最好在2h内观察 接受洗脱液的容器要密封,,第三节 赭曲霉毒素A的检验,赭曲霉毒素的理化性质,由曲霉菌，如赭曲霉、硫色曲霉、蜂蜜曲霉以及绿青霉等产生的一类毒素 赭曲霉毒素A（OTA）毒性最大，在霉变谷物、饲料等最常见 OTA微溶于水、石油醚，加碱成盐，水溶解性增大 酸性时，溶于苯、氯仿 对紫外线不稳定，几天即分解（应避光）,用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取样品中的赭曲霉毒素A，样品提取液经液-液分配后，根据其在365 nm紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量 采用双相展开法,薄层色谱法,GB/T 5009.96-2003,氯仿层,样品粉碎,过滤,,,氯仿 磷酸,NaHCO3,,水层,氯仿层,,,蒸干,备用,,苯-乙腈,盐酸 氯仿,提取（甲法）,甲醇-水层,样品粉碎,过滤,,,石油醚 甲醇-水,,氯仿层,震荡,,,氯仿层,备用,,苯-乙腈,NaCl饱和溶液,提取（乙法）,氯仿,点样、纵展,展开剂： 无水乙醚 乙醚-甲醇-水,纵展2～3cm,,横展,展开10～12cm,样品+标液,,,,展开剂： 无水乙醚 乙醚-甲醇-水,,纵展,展开剂： 甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水 甲苯-乙酸乙酯-甲酸 苯-冰乙酸,纵展13～15cm,,观察及确证,365nm,与标准点的相应处有黄绿色荧光,,确证,用碳酸氢钠乙醇溶液喷洒色谱板，室温下干燥,紫外灯,,OTA荧光点应由黄绿色变为蓝色,稀释定量,比较样液中OA与标准OA点的荧光强度，估计稀释倍数。

薄层板经双向展开后，当样品中OA含量高时，OA的荧光点会被横向拉长，使点变扁，或分成两个黄绿色荧光点在横展过程中，原点上OA的量超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂质和残留溶剂在横展中将OA点横向拉长了稀释定量,这时可根据OA黄绿色荧光的总强度与标准荧光强度比较，估计需减少的滴加微升数或所需稀释倍数 经稀释后测定含量时，可在样液点的左边基线上滴加二个标准点，OA的量可为4ng、8ng，比较样液与两个标准OA荧光点的荧光强度，概略定量,方法说明,本标准规定了谷物和大豆中OTA的薄层色谱测定方法 本标准适用于小麦、玉米和大豆中OTA的测定 薄层板上OTA的最低检出量为4ng 本方法的最低检测量为10μg/kg 标准使用液冰箱黑纸避光,,第四节 展青霉素的检验,,一、 展青霉素的理化性质 无色结晶，熔点110℃，在70-100℃可升华； 溶于水和乙醇； 在碱性条件下不稳定，在酸性溶液中较稳定，耐热 二、食品中的来源 主要存在于腐烂水果及其制品中 展青霉素由荨麻青霉、扩张青霉和棒曲霉等霉菌代谢产生的三、 毒性与危害 四、卫生标准 五、分析方法 展青霉素的测定方法有气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法。

我国的标准分析方法为双向薄层扫描定量测定法双相薄层扫描测定法,用乙酸乙酯提取果汁，利用1.5%碳酸钠净化样品，经双向薄层分离后，利用薄层扫描仪进行紫外反射光扫描定量本方法适合于苹果、山楂制品及其半成品中展青霉素的测定,GB/T 5009.185-2003,薄层扫描仪,展青霉素的提取,果汁： 加乙酸乙酯，振摇2min，静置分层重复以上步骤两次，合并有机相 有机相加碳酸钠，振摇1min，静置分层后，弃去碳酸钠层，再用碳酸钠重复处理一次 提取液滤真空减压浓缩近干，用少许三氯甲烷清洗瓶壁，浓缩干，加三氯甲烷定溶，供薄层色谱分析用展青霉素的提取,鲜苹果、果酱： 苹果洗净、削皮、打碎 置研钵中，加无水硫酸钠研磨后转至锥形瓶 加乙酸乙酯浸泡、振荡，过滤 滤液减压浓缩近干，用少许三氯甲烷清洗瓶壁，浓缩干，三氯甲烷定溶，供薄层色谱分析用薄层分析 点样,标液与样液相差3cm 在样品点用一垂直线上，距顶端2cm处点20ng的标准液，为位置参考点固定相：硅胶GF254,,,,薄层分析 双向展开,先横向，排除杂质的干扰，再纵向 在波长254nm紫外灯下观察， 展青霉素Rf值约为0.35，若样品点出现黑点，则样品为阳性。

根据样液黑色吸收点的强度高低，稀释不同倍数后，再点样10μL，使每个样品点展青霉素的绝对量在10~100ng之间，经双向展开后，进行扫描定量测定确证,阳性样品的验证： 将阳性样品的薄层色谱板喷以MBTH显色剂，130℃烘烤15min，冷却至室温后，于波长360。