核酸、多糖和脂类的组织化学幻灯片资料.ppt

组织化学技术概论 组织化学是在形态学基础上，通过化学或物理反应原理，研究细胞或组织中物质的化学组成、定位、定量以及代谢状态的学科是组织学与生物化学的边缘学科其目的是联系形态、化学成分和功能来了解细胞或组织的代谢变化组织化学反应如与电镜技术结合，简称电镜组化通过离心技术对分离的细胞进行的组织化学反应及细胞光度计的测量，则属于细胞化学的范畴分布于组织中的物质能作为抗原时，则可在组织切片上观察该物质的抗原抗体反应，为此所采用的技术方法称为免役组织化学方法一般组织化学方法 应用一些化学试剂与组织或细胞内的生物大分子或有机小分子等物质发生化学反应，形成有颜色的反应物沉淀，以原位显示相应成分在组织或细胞内的分布或含量 基本要求：o在操作中必须保持组织或细胞形态结构的完整状态免受破坏，以确保反应产物的定位准确o反应产物必须为有色沉淀，定位于原位，不被溶解，且反应物沉淀颜色深度与相应物质含量 有一定的量效关系o反应产物应具有一定的稳定性o反应具有一定的特异性，排除假阳性干扰o反应具有一定的灵敏性，必须能将含量极微的物质显示出来o 要有重复性方法稳定可靠，能被重复而结果不变 基本程序o组织的固定o组织切片的制备o染色漂洗o封固固定液的选择 核酸 蛋白质 多糖 脂类切片的制备常规石蜡包埋能改变组织内的化学反应，甚至将细胞内的一些可溶性物质完全丢失，故经常采用冰冻切片的方法。

最常用的是恒冷箱切片机新鲜组织的制备：新鲜组织取出后应尽快放入骤冷剂内骤冷以防产生冰晶常用的有注意 1. 力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理 2. 组织块不易过大过厚 3. 固定液必须有足够的量 4. 组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象核酸、多糖和脂类的组织化学 显示DNA和RNA的方法 (Feulgen反应 ) 原理 弱酸（1N Hcl）水解细胞核中DNA，打开嘌呤碱基和脱氧核糖连接的双键，释放出醛基，然后与Schiff试剂结合Schiff试剂的主要成分是碱性品红碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红-硫酸复合物碱性品红为醌状结构，硫酸破坏醌状结构而为无色的Schiff试剂与标本接触后，无色品红即与核酸水解后释放出的醛基结合成具有醌状结构的红紫色化合物，从而使DNA着色 试剂配制1. Schiff试剂 1N Hcl 20ml；碱性品红 1g；重亚硫酸钠 1g；活性炭；蒸馏水 200ml2.偏重亚硫酸水 10%偏重亚硫酸钠 5ml；1N Hcl 5ml；蒸馏水 90ml临用时配步骤 1在预热至60的1N Hcl中水解8-10分钟1N Hcl在临用前预热半小时 2冷1N Hcl稍洗。

3入Schiff试剂40-60分钟 4亚硫酸水洗三次，时间视颜色深浅而定 5流水冲洗5分钟 6蒸馏水洗 7甘油明胶封固 结果： 细胞核染成红紫色 对照： 在入预热的盐酸之前，用DNA酶消化DNA，其他步骤相同对照的切片DNA不着色 说明： 在加入活性炭之前，试剂颜色为草黄色为好试剂应配在棕色瓶中，并用黑色纸或塑料袋包好，密封避光保存，置于冰箱内，这样在4C可保存半年左右所用的瓶子要尽量小，防止SO2逸出2.Hcl的水解时间和固定液种类有关 糖原的染色（高碘酸-雪夫，PAS反应） 原理 通过高碘酸的强氧化作用，打开糖残基中二醇基（CHOH-CHOH）的碳-碳键，形成二醛基（CHO-CHO）这些二醛基与雪夫试剂中无色的亚硫酸品红反应生成紫红色的不溶性复合物（醛染料产物），从而证明多糖或粘多糖的存在试剂配制1. 0.1%过碘酸溶液2. 亚硫酸水3. Schiff试剂 操作步骤 1. 切片入0.1%过碘酸溶液15分钟 2. 蒸馏水洗 3. 入Schiff试剂15-60分钟 4. 亚硫酸水洗三次 5. 流水冲洗5-10分钟，蒸馏水 6. 甘油明胶封固 结果： 糖原呈紫红色颗粒 碳水化合物组织化学染色（periodic acid Schiff reaction, PAS reaction) 对照 用淀粉酶消化对照。

切片用0.5%淀粉糖化酶37C消化30-40分钟或室温1小时，流水冲洗，蒸馏水洗，其他步骤相同经消化后的对照片糖原所在部位不呈紫红色（PAS阴性） 说明 1. 过碘酸溶液浓度不能超过2.5%，pH不超过5，室温下氧化时间不可过长 2. 若Schiff试剂已变成粉红色，则说明它已变质失效而不能使用 3. 组织切片可因多种原因而有自由醛基存在，可用相邻切片做阳性对照，即切片不用高碘酸氧化而直接进入雪夫试剂，若出现红色，即为假阳性必要时可在高碘酸氧化前用硼氢化钠封闭自由醛基 脂类的染色苏丹黑-B显示脂类法 原理: 苏丹黑-B溶解于脂滴中，使其染为黑色 试剂配制 : 苏丹黑染液 70%乙醇 100ml；苏丹黑-B 1g充分混合可加热煮沸2-3分钟，或把染料溶解放置2日后使之变成充分的饱和液用前过滤，此液不可久存 操作步骤: 1. 冰冻切片入50%酒精2分钟，再入70%酒精2分钟 2.切片入染色液20-60分钟（如置温箱可适当缩短时间） 3. 流水冲洗，蒸馏水洗 4. 甘油明胶封片 结果: 脂类及磷脂呈黑色 脂肪组织（adipose tissue) 对照 切片入氯仿-甲醇（2：1）溶液，室温下1小时，用梯度酒精脱氯仿-甲醇（由无水乙醇下行至70%乙醇，各2分钟），苏丹黑-B染液染色5-10分钟，以后步骤同。

脂类不显色 说明 1. 苏丹黑染液不能久存，易产生沉淀，须过滤后再使用 2. 配制苏丹黑染液，一般用70%乙醇配成饱和液，染料可随乙醇快速溶解于脂滴中，但有些脂类可被乙醇提取而有一定损失用50%乙醇配制染液较安全，但因其溶解度小，需相应延长染色时间。