活性多肽简介资料.ppt

生物活性肽—酪蛋白磷酸肽,,,生物活性肽,,所 谓生物活性肽(Bioactive Peptides，B A P)就是对生物机体的生命 活动有益或是具有生理作用的肽类，是一类分子量小于6000D ，具有多种生物学功能的多肽 其分 子结构复杂 程度不一，可从简单的二肽到环形大分子多肽，而 且 这些多肽可通过磷 酸化、糖基化或酰基化而被 修 饰 生物活性肽的吸收的特点,不需消化，直接吸收它表面有一层保护膜，不会受到人体的促酶 、胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、消化酶及酸碱物质二次水解，它以完整的形式直进入小肠，被小肠所吸收，进入人体循环系统，发挥其功能 吸收特别快吸收进入循环系统的时间，如同静脉针剂注射一样，快速 发挥作用 它具有l00％吸收的特点吸收时，没有任 何废物及排泄物，能被人体全部利用 主动吸收 吸收时，不需耗费人体能量,不会增加胃肠功能负担 起载体作用它可将人所食的各种营养物质运载输送到人体各细胞、组织、器官酪蛋白磷酸肽,,酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides，即CPPs)是以牛乳酪蛋白为原料，经水解、分离纯化而得到的一类富含磷酸丝氨酸的生物活性肽，它可作为无机离子载体促进肠膜对钙、铁、锌、硒、尤其是钙的吸收和利用。

由于CPPs具有很强的促钙吸收活性，正成为功能性食品添加剂的开发和研究热点结构特点,CPPs是由a-酪蛋白和G-酪蛋白经酶水解、分离纯化而得 到的一类富含有磷酸丝氨酸和谷氨酸的短肽 含有相同的结构，其基本核心结构可表示为： 一SerP — SerP — SerP — Glu — Glu-Glu,具有这种核心结构的磷酸肽分子中带有高度负电荷，能抵抗胃肠消化酶的攻击而免遭进一步分解，从而在体内仍能发挥其生理功能CPPs的功能,促进矿物质吸收,以钙为例，许多研究证实，CPPs促进钙质吸收的方式有两 种 ： 一种是在十二指肠的上端，在VD 的存在下，可促使钙以主动方式吸收 另外一种是在回肠及其末端，以被动方式吸收，它与前者不同，不直接受到机体功能、营养状况、年龄等影响CPPs促进钙的吸收以后一种方式为主访谈结果与析,CPPs促进 矿物质吸收的机理是： CPPs带有较多负电荷，既可以抵抗消化道中各种酶的水解 ，又可以通过磷酸丝氨酰与钙、铁等离子螫合形成可溶物，从而有效地防止溶解的金 属离子在小肠中性或偏碱环境中与磷酸根结合而形成磷酸盐沉淀，同时可有效地增加矿物质在体内的滞留时间，CPPs与金属离子的螯合物被肠 黏膜吸收后再释放出CPPs。

CPPs的功能,促进牙齿、骨骼中钙的沉积和钙化,具体原理为：CPPs磷酸丝氨酸簇结合钙后，以非结晶形式定位在牙蚀部位 磷酸丝氨酸钙盐提供自由的Ca2+和PO4-缓冲液，减少了釉质的脱矿，增强其再矿化，从而有效防止牙蚀细菌的侵蚀和造成脱矿物质的过程 CPPs的功能,促进动物体外受精和增强机体免疫力,其原因是CPPs促进精子对钙离子的吸收，增强精子顶体的反应能力 ，提高精子对卵细胞的穿透能力 CPPs还具有增强动物机体免疫力的功能，有研究发现 酪蛋白C端的磷酸基团对抗体的识别具有极高的 临界点CPPs的理化性质,,溶 解 性,起 泡 性,乳 化 力,热 稳定 性,CPPs产品具有良好的溶解性在 pH2.0~10.0内，均高于90%，且溶解性随pH的增高而增大 CPPs产品较酪蛋白具有更好的起泡性和泡沫稳定性CPPs产品乳化力较好但与酪 蛋白相比下降了约20%,在100℃,30 min条件下杀菌不会对产品外观造成改变,,CPPs的制备,目前工业制备CPPs的方法主要有钙--乙醇沉淀法、膜分离法和离子交换法3种其生产过程可大致分为酪蛋白的水解和CPPs的分离两步 钙--乙醇沉淀法生产CPPs的工艺路线：酪蛋白→胰蛋白酶水解→ 酪蛋 白水解液→钙--乙醇沉淀→分离→干燥→CPPs产品。

膜分离法生产CPPs的工艺路线 ：酪蛋白→酪蛋白水解液→过滤→分离→ 喷雾干燥→CPPs产品将酪蛋白配成一定浓度的溶液后，用2mol／L的NaOH调至pH8.3左右，加人一定量的胰蛋白酶进行水解，水解过程始终保持溶液pH在7.7～8.5之间，终止水解时加人1mol／LHcl使溶液pH达4.6．然后离心除去沉淀，在上清液中加人10mL CaC12溶液至终浓度为100mmol／L，再加入等体积的乙醇，离心收集沉淀，最后将沉淀用丙酮、乙醚洗涤后挥发干燥，即得CPPs的复杂混合物,乙醇钙沉淀法,经过阴离子交换树脂处理，除去非磷酸肽，得到含有一定CPP的粗制品再经过凝胶过滤柱 (Sephadex G 一25 )，得到不同分子量分布的两大组分CPPA、CPPB 根据其分子量分布的不同状况，取 CPPA 用于高效液相制备色谱分离 RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基键合硅胶，典型的流动相是甲醇和乙腈RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离 反相色谱法适于分离非极性、极性或离子型化合物，大部分的分析任务皆由反相色谱法完成反相高效液相色谱是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱）相反。

取不同体积的样品进行试验，考察进样量对于分离的影响当进样体积为 200- - 300μL 时，样品能达到较好的分离,三个主要组分al、a2、a3，冷冻干燥后，用电泳分析其纯度，发现al、a2、a3 均不是单一组分，而是含有2个或3个组分，因此，必须对al、a2、a3进一步分离用200—300nm的波长对CPPA进行扫描，最大吸收波长为215nm，故选215nm 作为检测波长 采用选择性更高的乙酸铵洗脱液代替三氟乙酸洗脱液，对a1、a2、a3 收集液再进行第二次分离 阴离子树脂纯化 CPP,原料：CPP初级品r(N/P)为7.52,大孔强碱性阴离子交换树脂,凝胶型强酸性阳离子交换树脂,原理：CPP在一定pH下带负电,而NPP带正电. 将一定浓度的 CPP 进样,带负电的CPP 被吸附于阴离子树脂上 , 用清水将未被吸附的 NPP 洗出 , 然后再用一定浓度的 HCl 洗脱 , 得到CPP洗脱液,pH 5.5、质量浓度为6g/dL的CPP悬浮液,3000r/min离心15min,取上清液以350mL/h的体积流量进样,同时测定上清液总氮、总磷含量,计算上清液的得率和r(N/P).,阳离子树脂纯化 CPP 原理：CPP在一定pH下带负电, 而NPP带正电. 将一定浓度的CPP进样 , 带正电的 NPP 被吸附于阳离子树脂上, 用清水将未被吸附的CPP洗出 , 得到CPP 洗脱液 .,用阴离子树脂纯化 CPP , 虽然达到了较好的分离效果 , 但从工业化规模生产 CPP 高纯品的角度来看 , 采用该法也有不 足之处 : 1)树脂在使用前和再生时需转型处理 , 能耗费 用较大 , 生产效率降低 . 2)总的分离时间较长 , 且操作分为两步 , 不利 于扩大生产 . 3)洗脱时使用的是一定浓度的 HCl , 使最终产 品带入了一定的盐分 . 4)从柱中洗脱下来的 CPP 溶液浓度很低 , 后 期浓缩干燥能耗费用较大,使用阳离子树脂纯化 CPP 有如下优点 : 1)阳离子树脂使用前无需转型处理 . 2)用阳树离子树脂纯化洗脱 CPP 只需一步 ,总操作时间只有采用阴离子树脂时的一半 . 3)用阳离子树脂纯化时洗脱用的是清水 , 未带入盐分 . 4)从交换容量的角度来看 , 在确保 r (N/ P) 5. 5 的前提下 , 还可通过提高进样浓度来进一步提高得率 , 这样洗脱液中 CPP 的浓度就可以提高 , 减 少了后面浓缩和干燥的费用,,CPPs的检测,CPPs主要采用高效液相色谱(HPLC)或高效毛细管区带电泳(HPCE)进行分离，并结合末端氨基酸分析技术以确定各种磷酸肽的一级结构。

直接定磷法、SDS—PAGE法、聚丙烯酰胺等电聚焦 电泳(IF E )法，这三种方法均可对CPPs进行定量测定，分别适用于产量测定、组分测定和精确度 测定CPPs是多种短肽的混合钧，其中大部分肽中含有成簇的磷酸丝氨酸序列 (-Serp— Serp-Serp-Glu-Glu-)，这一序列也正是CPPs的功能基团，其含量的多少与 CPPs功能特性直接相关．因此，肽链较短，磷酸丝氨酸基团较多的CPPs其持钙能力最强．而cPPs中磷和氮含量的比值(P／N)能较客观地反映CPPs链长和磷酸基的密度，可作为评价CPPs产品特性的重要指标直接定磷法,总 N 测定 半微量凯氏定氮法,,访谈结果与析,CPPs作为一种活性多肽，由于其稳定性好、安全、具有多种生物功能等而具有相当大的开发应用潜力其开发应用领域主要有如下几方 面 ： (1)研制功能性食品CPPs可作为营养强化剂添加到食品中制成壮骨剂或保 健食品，这方面已由美国、日本等国研究开发成功 (2)用于制药，例如用于对佝偻病、牙科病和骨质疏松症等疾病的治疗 (3)制成抗蛀牙牙膏、漱口液或含片等 (4)制成可促进动物体外受精和细胞融合的生化制剂。