第9章DNA序列分析教程文件.ppt

第九章 DNA序列分析第一节 Maxam-Gilbert化学降解法第二节 Sanger链终止法第三节 DNA片段序列测定的策略第四节 核苷酸序列的生物信息分析第一节 Maxam-Gilbert化学降解法 化学降解法：人们用专一性作用于A、T、G、C碱基的化学药剂分别处理经内切酶切割而成的一定长度DNA片段，通过控制反应时间，既可获得分别以A、T、G、C为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群 除了要研究与DNA的高级结构、DNA-蛋白质结构相关性采用化学降解法外，对于单纯以测序为目的的实验，普遍采用后面所讲的酶促合成法 第二节 Sanger链终止法1977年Sanger设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法，进行DNA序列测定，即双脱氧链终止法Sanger法获得诺贝尔化学奖一、Sanger双脱氧链终止法原理在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5-引物端和以ddNMP残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。

由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列二、双脱氧终止法测序反应体系：DNA聚合酶单链DNA模板带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物Mg2+4种dNTP (aATP、dGTP、dCTP和dTTP)4种ddNTP (ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP)Sanger法DNA测序的试剂 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 模板 DNA聚合酶 2,3-双脱氧核苷三磷酸（2,3-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP） dNTP三、测序反应的种类 引物标记法(Dye primer reactions) 终止物标记法(Dye terminator reactions)This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached to the 3 carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger to the 3 carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.This figure is a representation of an acrylamide sequencing gel. Notice that the This figure is a representation of an acrylamide sequencing gel. Notice that the sequence of the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5 to 3 sequence of the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5 to 3 ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand, 5 ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand, 5 to 3, is AATCTGGGCTACTCGGGCGTto 3, is AATCTGGGCTACTCGGGCGT测序过程:1.模板与引物杂交2.引物的延长和合成阻断四个试管分别加入：DNA聚合酶、dNTPs、标记引物终止剂不同：ddA、ddG、ddC、ddT四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链3.电泳：ACGT次序，高压电泳4.放射自显影得到直读图象第三节 DNA片段序列测定的策略人类基因组计划的核心内容之一是基因组测序。

随着人类基因组图谱趋于完成，人类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序取得了突破性进展，测序策略的成熟、测序方法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能力的提高，大大推进了大规模DNA测序的进程一、定向测序策略定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列分析二、随机测序战略随机测序战略又称鸟枪战略(shotgunstrategy)，此策略是将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2kb左右的小片段，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列三、多路测序战略多路测序战略(Multiplexmethod)是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅读，快速分析DNA序列的一种技术这种方法的复合随机克隆文库来源于相同的基因组DNA将DNA片段克隆到20种不同的质粒载体上，再亚克隆进不同的质粒载体将来源20个亚克隆库的克隆进行测序四、大规模DNA测序的趋势自动化DNA测序实现规模化的重要条件是自动化和机械化。

目前，DNA制备、克隆文库组建及筛选、DNA测序分析、数据的分析获得、碱基序列阅读、重叠克隆群顺序排定等过程均已平行发展，自动化操作紧随其后随着DNA测序不断由半自动化向自动化过渡，原始数据积累将不成问题，关键是把全基因的散测序组装起来，以实现DNA测序的完整性目前，在亚克隆筛选、模板制备、测序反应、碱基阅读等方面均在一定程度上实现了自动化1、克隆筛选从亚克隆文库中寻找并筛选单一克隆已逐步实现了自动化2、模板制备现有的机器人被用来自动分离DNA并制备适于传统操作程度的测序模板特定用途的DNA分离仪也已采用3、测序反应由于手工测序不能保证所需的再生产能力、高通量和准确的重复性，所以，DNA测序反应的自动化对大规模测序是至关重要的4、自动放射性自显影阅读机近几年来，自动化放射性自显影阅读机纷纷上市，并不断向商业化及科研应用方向发展5、自动测序仪DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化310型全自动遗传分析仪DNA全自动分析仪：ABIPrism3100遗传分析仪 3700型全自动遗传分析仪安玛西亚DNA序列分析系统型号：MegaBACE500/1000/4000 分析仪器的新发展： 377型遗传分析仪 3730型遗传分析仪 377型DNA全自动测序仪采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，结合美国应用生物系统(ABI)公司专利的四色荧光标记，激光检测，一个泳道检测的方法，一个测序反应保证500bp的准确序列。

3730型DNA全自动测序仪采用毛细管电泳，速度更快，效果更好，通量更大，一个测序反应保证800bp的准确序列，是当前基因测序的主打优点：i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间； ii. 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影； iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列缺点：无法保留原始记录, 四个反应产物点在一条道上, 相互间会发生干扰, 导致读序时分辨率下降DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，一是指“分析反应”的自动化，另一方面则是指“读片过程”的自动化西南大学生物技术专业 基因工程25一、分析的核心网站http:/www.ncbi.nlm.nih.govhttp:/bip.weizmann.ac.ilhttp:/au.expasy.org/tools/#primaryhttp:/www.ebi.ac.uk/embl/http:/www.ddbj.nig.ac.jp/二、本地分析的重要软件VectorNTISuite6.0及以上的版本：综合分析、载体分析DNAStar：综合分析PrimerPremier5.0：引物设计Oligo7：寡核苷酸分析，引物计算GCG：蛋白质、核酸序列第四节 核苷酸序列的生物信息分析西南大学生物技术专业 基因工程26三、Genbank序列检索西南大学生物技术专业 基因工程27西南大学生物技术专业 基因工程28西南大学生物技术专业 基因工程29西南大学生物技术专业 基因工程30四、DNA、RNA和蛋白序列序列创建分子分析西南大学生物技术专业 基因工程31西南大学生物技术专业 基因工程32五、序列多重比对西南大学生物技术专业 基因工程33西南大学生物技术专业 基因工程34六、引物设计西南大学生物技术专业 基因工程35七、BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool):Genbank同源性搜索西南大学生物技术专业 基因工程36西南大学生物技术专业 基因工程37西南大学生物技术专业 基因工程38西南大学生物技术专业 基因工程39西南大学生物技术专业 基因工程40西南大学生物技术专业 基因工程41八、DNA和蛋白结构预测西南大学生物技术专业 基因工程42西南大学生物技术专业 基因工程43西南大学生物技术专业 基因工程44。