基因克隆及蛋白表达p培训讲学.ppt

基因克隆及蛋白表达细胞生物学教研室细胞生物学教研室李丰李丰研究某一目的基因功能一般策略 目的目的DNADNA获得来自三条途径获得来自三条途径: :l l1.1.genomegenome上的特定区域或序列上的特定区域或序列l l2. 2.含有目的含有目的DNADNA的质粒的质粒l l3. 3.从从cDNAcDNA文库中扩增单个已知文库中扩增单个已知cDNAcDNA获得目的获得目的DNADNA构建含目的构建含目的DNADNA质粒质粒转化细菌转化细菌蛋白表达纯化蛋白表达纯化转染真核细胞转染真核细胞蛋白定位、表达及表型变化蛋白定位、表达及表型变化第一部分PCR一、PCR实验原理一、PCR实验原理二、PCR的反应体系 1.PCR1.PCR引物引物（1 1） primerprimer长度：长度：18-30bp18-30bp 引物短引物短特异性降低特异性降低引物长引物长影响产物生成影响产物生成（2 2） primerprimer浓度：浓度：0.1-1.00.1-1.0umol/Lumol/L 浓度过高浓度过高错配、引物二聚体增加错配、引物二聚体增加浓度过低浓度过低PCRPCR效率降低效率降低二、PCR的反应体系 2.2.缓冲液缓冲液 KClKCl、Tris-ClTris-Cl、MgClMgCl2 2 ， MgMg2+2+：1.51.52.0mM2.0mMMgMg2+2+: : DNADNA聚合酶聚合酶 活性活性 PCRPCR产量产量MgMg2+2+:PCR:PCR反应特异性反应特异性二、PCR的反应体系 3.DNA3.DNA聚合酶聚合酶TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 LADNALADNA聚合酶聚合酶 PrimeSTARPrimeSTAR(PyrobestDNA(PyrobestDNA聚合酶聚合酶) )PfuDNAPfuDNA聚合酶聚合酶Taq DNA polymerase553353355533DNADNA聚合酶活性。

在模板和引物存在的条聚合酶活性在模板和引物存在的条件下，以件下，以dNTPdNTP作为底物，沿作为底物，沿5533方向合成与模方向合成与模板互补的板互补的DNADNALATaqDNAPolymeraseLATaqDNAPolymerase1.51.53DNA3DNA聚合酶活性；聚合酶活性；2.32.35DNA5DNA外切酶活性外切酶活性Pyrobest & pfu DNA Polymerasel lTaqDNATaqDNA聚合酶活性聚合酶活性l l3355外切酶活性，可信度极高外切酶活性，可信度极高l lPCRPCR产物为平滑末端产物为平滑末端PCR的反应体系4dNTP:50-200umol/L5.模板DNA（1）单链DNA（2）双链DNA（3）浓度：基因组DNA：1ug质粒DNA：10ng三、基本操作步骤l1.变性变性(denature)(denature):95高温下,双螺旋氢键断 l 裂,双链DNA解链成为单链DNAl2.退火退火(annealing)(annealing):两条引物与模板DNA扩增区 l 域的两端按碱基互补配对结合.l3.延伸延伸(extension)(extension):在4种dNTP底物及Mg2+存在l条件下,TaqDNA聚合酶在72下,将单核 l 苷酸按碱基互补配对原则从引物3端掺l 入,使引物沿53方向延伸合成新股DNA四、条件优化l l1.1. 变性变性: : 9595变性变性20-30s,20-30s,即可使各种即可使各种DNADNA完全变完全变性。

性l l2.2. 退火退火: :引物与模板退火温度由引物长度和引物与模板退火温度由引物长度和GC%GC%决决定定, ,退火温度一般应比退火温度一般应比TmTm值低值低4-12 4-12 为宜为宜, ,退火退火时间一般为时间一般为20-40s20-40sl l3.3. 延伸延伸: :通常通常68-7568-75延伸时间取决于扩增片断延伸时间取决于扩增片断的长度的长度. . 可以可以500bp/30s500bp/30s为基准，根据目的片断为基准，根据目的片断的长度计算反应时间的长度计算反应时间l l4.4. 循环次数循环次数：一般为：一般为25-3525-35次PCR反应液l lPCRBufferPCRBuffer（MgMg2+2+）2.5l2.5ll ldNTPdNTP混合物（各混合物（各2.5mM2.5mM）4l4ll l模板模板DNA1lDNA1ll l引物引物1 1（20uM20uM）0.5l0.5ll l引物引物2 2（20uM20uM）0.5l0.5ll lTaqDNApolymeraseTaqDNApolymerase（5U/ul5U/ul）0.25l0.25ll lddHddH2 2OO至至25l25lPCR反应条件 94 5minl94 30secl55 30sec 30 Cyclesl72 1minl72 10minl 4 forever五、PCR引物的设计l lPCRPCR反应成功的一个关键条件是正确设计反应成功的一个关键条件是正确设计引物引物l lPCRPCR引物设计目的是在扩增特异性和扩增引物设计目的是在扩增特异性和扩增效率两个目标上取得平衡效率两个目标上取得平衡. .l l可以利用计算机软件进行引物设计可以利用计算机软件进行引物设计, ,引物设引物设计软件会通过每一引物设计变化的预定值计软件会通过每一引物设计变化的预定值在两个目标间取得平衡在两个目标间取得平衡, ,找出最佳引物找出最佳引物. .l l有时也需根据实验的具体要求进行适当调有时也需根据实验的具体要求进行适当调整整. .引物设计的基本原则 l l( (一一) )引物长度引物长度l l在在16-30bp16-30bp范围内范围内, ,以以18-24bp18-24bp为最佳为最佳. .l l引物过短引物过短, ,产物特异性降低产物特异性降低, ,每增加一个核苷酸每增加一个核苷酸, ,引物特异性可增加引物特异性可增加4 4倍倍. .l l引物的长度是指与模板引物的长度是指与模板DNADNA序列互补的部分序列互补的部分, ,不不包括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列包括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列. .引物设计的基本原则l l( (二二) )引物末端引物末端l l1.1.引物的引物的3 3末端对于末端对于PCRPCR反应是关键反应是关键. .l l2.2.引物的引物的33末端的第一和第二个碱基影响末端的第一和第二个碱基影响Taq Taq DNADNA聚合酶的延伸效率聚合酶的延伸效率, ,故其影响故其影响PCRPCR反应的扩反应的扩增效率及特异性增效率及特异性. .引物引物33末端最佳碱基选择末端最佳碱基选择G G或或C C，因为它们形成的碱基配对比较稳定。

因为它们形成的碱基配对比较稳定引物设计的基本原则l l3. 3. 引物引物55末端的碱基无严格限制末端的碱基无严格限制l l当引物的长度足够时当引物的长度足够时, , 引物引物5 5末端的碱末端的碱基可不与模板基可不与模板DNADNA互补而呈游离状态可互补而呈游离状态可在在5 5端加上限制内切酶位点端加上限制内切酶位点, ,启动子序列启动子序列或其他序列等或其他序列等, ,以便于以便于PCRPCR产物的分析克产物的分析克隆引物设计的基本原则l l4.4.在一个在一个PCRPCR反应中的一对引物之间不应反应中的一对引物之间不应存在互补序列存在互补序列, ,特别是特别是33末端应尽量避末端应尽量避免互补免互补, ,以免形成以免形成“引物二聚体引物二聚体”造成引造成引物浪费和非特异性的扩增物浪费和非特异性的扩增. .l l5.5.每个引物的内部应尽量避免形成二级每个引物的内部应尽量避免形成二级结构结构, ,特别是引物的末端应无回文结构特别是引物的末端应无回文结构. .引物设计的基本原则l l( (三三) )引物的引物的GCGC含量和含量和TmTm值值l lPCRPCR引物引物G+CG+C碱基的含量应保持在碱基的含量应保持在45-65%45-65%之间，之间，G+CG+C含量一般为含量一般为40-60%40-60%。

其其TmTm值是寡核苷酸的解值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，链温度，即在一定盐浓度条件下，50%50%寡核苷酸寡核苷酸双链解链的温度双链解链的温度l lPCRPCR扩增中的复性温度一般是较低扩增中的复性温度一般是较低TmTm值引物的值引物的TmTm值减去值减去5-105-10度引物长度小于度引物长度小于20bp20bp时时, , Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T) 引物设计的基本原则l l( (四四) )引物的位置引物的位置l l1.1.引物的序列应位于基因组引物的序列应位于基因组DNADNA的高度保守区的高度保守区，且与非扩增区无同源序列，这样可减少引物，且与非扩增区无同源序列，这样可减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性与基因组的非特异结合，提高反应的特异性l l2.2.若以若以cDNAcDNA为模板，则首先应尽量使引物和产为模板，则首先应尽量使引物和产物保持在物保持在mRNAmRNA的编码区域内；其次，尽量把引的编码区域内；其次，尽量把引物放在不同的外显子上，以便使特异的物放在不同的外显子上，以便使特异的PCRPCR产产物与从污染物与从污染DNADNA中产生的产物在大小上相区别中产生的产物在大小上相区别。

引物设计的基本原则l l（五（五)Primer )Primer primer primer 5.05.0辅助的引物设计步骤辅助的引物设计步骤及条件优化及条件优化第二部分RT-PCRRT-PCRl l是将是将RNARNA反转录和反转录和PCRPCR结合起来建立的结合起来建立的一种一种PCRPCR技术首先进行反转录产生技术首先进行反转录产生cDNAcDNA，然后进行常规，然后进行常规PCRPCRcDNA合成l Superscript first-strand synthesissystemforRT-PCR是从总RNA或mRNA合成cDNAlRNA量为1ng5ugReverse Transcriptase553353351. 1.依赖于依赖于RNARNA的的 5533 DNADNA聚合酶活性（聚合酶活性（反转录活性）；反转录活性）；2. 2.依赖于依赖于DNADNA的的553DNA3DNA聚合酶活性聚合酶活性Reverse TranscriptaseRNADNADNA3.RNase3.RNaseHH活性：特异性识别并分解活性：特异性识别并分解RNA-RNA-DNADNA杂交体中的杂交体中的RNARNA链链RT-PCR 用M-MuLV反转录酶（RNase H-）进行cDNA第一链的合成 l lRNaseRNaseHH缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒（缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-M-MuLVMuLV）反转录酶是一种）反转录酶是一种RNARNA介导的介导的DNADNA聚合酶聚合酶。

该酶能以该酶能以RNARNA或者单链或者单链DNADNA做模板由引物起始做模板由引物起始合成一个互补的合成一个互补的DNADNA链RNaseRNaseHH活性的缺失增活性的缺失增强了该酶合成长链强了该酶合成长链cDNAcDNA的能力 l l编码编码M-MuLVM-MuLV反转录酶的基因在重组大肠杆菌中反转录酶的基因在重组大肠杆菌中表达，该酶在其表达，该酶在其RNaseRNaseHH区域含一点突变，从而使区域含一点突变，从而使修饰后酶的修饰后酶的RNaseRNase活性缺失，但反转录功能不受影活性缺失，但反转录功能不受影响用M-MuLV反转录酶（RNase H-）进行cDNA第一链的合成 l l进行进行PCRPCR前用前用RnaseHRnaseH消化 去除与去除与cDNAcDNA结合的结合的RNARNA，增加，增加PCRPCR敏感性 第一链合成过程中第一链。