离心分离和沉淀分离p知识课件知识讲稿.ppt

单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*1离 心 分 离0 概述n固液分离的常用手段n分类：离心沉降离心过滤超离心1 离心沉降原理球形粒子沉降在离心力场中离心机的种类与用途按速度和离心力：1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机 1104-2.5104rpm，相对离心力104105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3、超速离心机 转速2.5-8104rpm，相对离心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等 瓶式离心机1）斜角式离心机v是一类结构最简单的实验室常用离心机，v指离心管腔与转轴成一定倾角的转子；v角度越大，沉降越结实，分离效果越好，v角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差v颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积2）平抛式离心机v平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在 3000-6000rpmv 转子活动管套内的离心管，静止时垂直挂在转头上，旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到水平位置（约200800rpm）。

v颗粒在水平转子中的沉降是沿管子轴向移动v样品便于收集v受振动和变速搅乱后对流现象小，v但转头结构复杂，最高转速相对要低v容量也小一些 平抛式离心机转子2 离心沉降设备n瓶式离心机n也称平抛式离心机n结构最简单的实验室常用的低，中速离心机，n转速一般在 3000-6000rpm2 离心沉降设备n管式离心机n液-液分离；液-固分离n结构简单n转速很高n可连续操作（液-液）2 离心沉降设备n碟式离心机n固体的沉降距离极短，分离效果较好n碟片间的距离一般为0.52.5mm,与被分离物料的性质有关n液-液分离；液-固分离n连续操作2 离心沉降设备多室式离心机n增加了沉降面积，减少了沉降距离n同时还有粒度筛分的作用n常用于抗菌素液液萃取分离n间歇式生产n管式离心机3 离心沉降的计算rz管壁单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*14沉 淀 分 离概述n 沉淀（定义） 是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程n沉淀具有选择性 有选择地沉淀杂质 有选择地沉淀所需成分优点：操作简单、经济、浓缩倍数高优点：操作简单、经济、浓缩倍数高缺点：针对复杂体系而言，分离度不高缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强、选择性不强概述n 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行。

n操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：蛋白质的溶解特性n蛋白质是两性高分子电解质n在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强n亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面n蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域概述n沉淀法操步骤 ：沉淀剂粒子生长收集沉淀物过滤离心概述沉淀法（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）高价金属离子沉淀法等除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子外，其他各种方法只适用蛋白质等大分子分类蛋白质盐析n因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀蛋白质稳定因素水化层双电层使蛋白质形成稳定的胶体溶液静电排斥作用蛋白质盐析中性盐蛋白质脱水中和电荷沉淀盐析法机理（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。

2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀蛋白质盐析盐析用盐的选择n n盐析作用要强盐析作用要强n n盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度n n盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的n n来源丰富、经济来源丰富、经济n盐析操作蛋白质盐析直接加入固体(NH4)2SO4 粉末，工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；是加入硫酸铵饱和溶液，在实验室和小规模生产中，或(NH4)2SO4 浓度不需太高时，可采用这种方式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释蛋白质盐析n阴离子：柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-n阳离子：NH4+ K+Na+ 高价阳离子n硫酸铵：（1） 价廉 ；（2） 溶解度大，稳定蛋白质 ；（3）水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响盐析效果n影响因素蛋白质盐析pH 变化温度变化等电点附近有极小值随温度升高减小，热促失水膜lgS蛋白质盐析盐析注意事项： (1) 稳定pH 用磷酸缓冲液（2）硫酸铵加入后体积变大（3）选择饱和度（4）分步盐析（5）初始蛋白浓度 S=-sS蛋白质的溶解度，g/L; I离子强度， I=1/2mizi2 mi离子 i的摩尔浓度；Zi所带电荷常数，图中截距Ks盐析常数，图中直线斜率Cohn经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系等电点沉淀法n原理：调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。

适用于疏水性较强的蛋白质pH=pI等电点沉淀法（1）适用于疏水性强的蛋白质（2）中性盐浓度增大时，等电点向偏 酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大 （3）无机酸通常价格便宜，无毒（4）蛋白质对低pH 敏感，易失活操作注意事项等电点沉淀实例n从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3O)n工业生产胰岛素(pI5.3)时：先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)等电点沉淀法细胞色素C洗脱液（离交）+ 硫酸胺（饱和度86%） 低温离心 上清液调 pH4.8- 5.1 产物 沉淀（杂蛋白）有机溶剂沉淀法l l概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出优点在于：优点在于：1 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2 2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；缺点是缺点是1 1）对具有生物活性的大分子容易引起对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，变性失活，2 2）操作要求在低温下进行。

操作要求在低温下进行3 3）成）成本高本高nA 降低溶剂介电常数.nB 破坏水化膜：nC 相反力：有机溶剂沉淀法机理减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层降低介电常数破坏水化膜常用的有机溶剂沉析剂常用的有机溶剂沉析剂选择依据：n水溶性要好n介电常数要小n致变性作用要小（甲醇）n毒性要小、挥发性适中n容易获取n沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇乙醇是最常用的沉淀剂n乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；n丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；温度使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，有机溶剂沉淀法的影响因素pH值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近 举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液 加乙醇（70%）搅拌 -淀粉酶n n* pH影响n 收率% 酶活 n 收率n 酶活n 6.5 pHn * 适宜的pH 5.6 6.0 * 温度影响 收率% 酶活 酶活 收率 10 20 T * 适宜的温度10 20 例： 调pH4.2 上清液胰岛素粗品溶液 30 % 丙酮 沉淀（杂蛋白）调pH6.0 上清液Zn2+ 胰岛素锌盐。