郜刚分子生物学-09-2-电泳技术.ppt

分子生物学讲义5.2.1 电泳垂直 管式凝胶电泳仪适宜将凝胶蛋白快速转印到硝酸纤维薄膜上适宜将凝胶蛋白快速转印到硝酸纤维薄膜上 等点聚焦电泳仪水平琼脂糖凝胶电泳仪电泳法 自由电泳（无支持体） 区带电泳（有支持体） 自由电泳 区带电泳Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳 琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶 电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵 琼脂糖凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶的特点天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶组成琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果 琼脂糖凝胶电泳 优点操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳 结构均匀，含水量大（约98%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定 易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。

制成干膜可长期保存 常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作质粒分离等 琼脂糖凝胶电泳 用途DNA的琼脂糖凝胶电泳分离原理 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型同时与凝胶的浓度也有密切关系 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系（1）DNA分子的大小在凝胶中，DNA迁移率与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值 （2）琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素DNA的大小DNA的构象*琼脂糖浓度*缓冲液*不同构像质粒2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度次序为： 共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。

3、电泳方法（1）凝胶类型垂直型及水平型（平板型）潜水式：水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，受欢迎 （2）缓冲液系统EDTA（pH8.0）Tris-乙酸（TAE） 缓冲能力较低Tris-硼酸（TBE） 容易沉淀Tris-磷酸（TPE） 浓度约为50mmol/L（pH7.5-7.8）电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性3）凝胶的制备溶胶：以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉熔化灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却4）样品配制与加样DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%-10%甘油，以增加其比重，使样品集中为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5%Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油 （5）电泳低浓度、低电压下，分离效果较好在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。

但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4进行电泳6）染色和拍照常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析 实验操作 1. 用胶带将洗净、干燥的水平板的边缘封住，形成一个胶模并水平放置 2. 按水平板的长宽0.5cm胶厚，量取0.5TBE，并按0.7的浓度称取agarose琼脂糖，在微波炉或电炉上加热至全熔* （清澈透明） 3. 等凝胶温度降至大约5060以下时，加入1 mg/L溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5ug/mL ；摇匀并轻快地倒入水平板中，除掉气泡，插入梳子 4. 凝固后，将梳子轻轻拔出5.去掉胶带，将水平板放入加有0.5TBE电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm5.去掉胶带，将水平板放入加有0.5TBE电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。

6.在parafilm膜上依次加：ddH2O 6ul上样Buffer 2ulDNA 4ul分别混匀后点样，记录点样次序7. 在水平板两边的点样孔中加入marker8. 盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压（5V/cm）及电泳方向（DNA阴极到阳极），开始电泳9. 当色素接近胶的先端，停止电泳，样品在紫外灯下观察、成像脉冲电场凝胶电泳（PFGE）1984年，D.R.Cantor发明的分离超大分子量的DNA分子在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的PFGE can resolve large DNA fragments。