抗原抗体反应与非标记免疫分析.ppt

抗原抗体反应与非标记免疫分析,概念： 是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合 体内反应：中和消除异物，维持正常 体外反应：诊断、鉴别抗原或抗体 血清学反应： ≠抗原抗体反应,第一节 抗原抗体反应,抗原抗体反应在体外，依相应抗原物理性状 （颗粒状或可溶性）以及反应的条件 （电解质、补体等）不同，可出现凝集、沉淀、细胞溶解和补体结合等反应分为两个阶段 第一阶段：特异性结合——不可见 第二阶段：免疫复合物沉积——可见,物质基础: 抗原表位与抗体高变区间的互补结合 抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合 抗原抗体之间的结合力 亲水胶体转化为疏水胶体,,一、抗原抗体的结合力,抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合 不形成牢固的共价键，通过非共价键结合 这种弱的结合力涉及几种分子间的作用力,*1．静电引力 ：相反电荷的基团之间距离越近，作用力越强 *2．范德华引力：电子云产生 *3．氢键结合力：氢原子间 *4．疏水作用：疏水基团排水积聚的力 最强的抗原抗体反应力静电引力 （electrostatic forces） 范德华引力:作用最小 （van der Waals interactions） 氢键:最具特异性 （hydrogen bond ） 疏水作用力:作用最大 （hydrophobic interactions）,抗原抗体结合力示意图,抗原抗体结合力,二、抗原抗体的亲和性和亲和力,亲和性是抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间的相适应性而存在着的引力，这是抗原与抗体之间固有的结合力。

抗体亲合力是指反应系统中复杂抗原与相应抗体之间的结合能力多价优势亲和力与亲和性、抗体的结合价和抗原的有效决定簇数目相关 亲和力越大，抗原抗体结合越牢固三、亲水胶体转化为疏水胶体,血清学反应条件下，抗原抗体均带负电荷， 使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体 当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄；而且由于抗原抗体复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体 在电解质作用下，各疏水胶体之间靠拢，形成可见的抗原抗体复合物返回,亲水胶体,疏水胶体,,转化,,NaCl,可见反应,,,可见反应(沉淀),抗原抗体复合物 (疏水胶体),电解质,抗原 (亲水胶体),抗体 (亲水胶体),+,,第二节 抗原抗体反应的特点,1. 特异性 2. 比例性 3. 可逆性,特异性：抗原与抗体结合反应的专一性,,抗原抗体反应特异性示意图,分子基础：抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性,一、特异性,*交叉反应(cross reaction) 两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇， 则可与彼此相应的抗体反应交叉反应,特异性示意图,,,,,,,前带：抗体过量 后带：抗原过量 等价带：抗原抗体比例合适,,抗原抗体反应比例性示意图,比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系,二、比例性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,网格学说（lattice theory）,抗体过剩,抗原过剩,抗体抗体比例合适,比例性示意图,抗体过量,比例合适,抗原的量,抗原过量,抗体沉淀的量,,,前带,等价带,后带,三、可逆性,概念：是指抗原与抗体复合物在一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性。

解离后抗原抗体仍保持原有特性 一定条件：低pH、高浓度盐等 常用于解离抗原抗体复合物的物质有： 3mol/L硫氰化钾、pH2.4 0.1mol/L甘氨酸、 7mol/L尿素等抗体,混有Ag,抗体-Ag,抗体-Ag,分离剂,一、抗原抗体结合,二、分离抗体,可逆性示意图,抗体,1,1,1,可逆性,,,,,,,,K（亲和常数）=,,Ag+Ab,Ag Ab,,,,四、影响抗原抗体反应的因素,（一）反应物自身因素 *抗原： 1. 理化特性 2. Ag决定簇数量 3. Ag决定簇种类,例如，可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀，而颗粒性抗原与相应抗体反应则出现凝集; 单价抗原与抗体结合不出现可见反应; 粗糙型细菌在生理盐水中易出现自凝； 红细胞与IgG类抗体结合不出现直接凝集等抗体：1. 来源 2. 特异性与亲合力 3. 浓度 来源：来自不同动物的免疫血清，其反应性有差异家兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的等价带，通常在抗原过量时才易出现可溶性免疫复合物；马等大动物和人的免疫血清等价带较窄，少量的抗原或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复合物；家禽免疫血清不能结合哺乳动物的补体，并且在高盐浓度（80g/L） NaCl溶液中沉淀现象明显。

单克隆抗体一般不适用于沉淀反应或凝集反应二）环境条件： *电解质：0.85% NaCl *酸碱度：pH 6～9 *温度：15～40 ℃ *酸凝集：当pH为3左右时，接近细菌Ag的等电点，可出现非特异性凝集酸碱度,温度,作用时间,抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含特异性抗体的血清 多克隆抗体 （PAb）： 多个抗原决定簇免疫机体所产生的多种抗体的混合物多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb） ：只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体,第三节 抗血清的制备和抗体的纯化,抗原,表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）,Ag,,,,,,,,,1,2,3,4,Ag,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,单克隆抗体,B1,B2,B3,B4,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,B3,B3,B3,B3,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2,多克隆抗体,3,4,,,,,1,,,,,,,,,,,,1、单克隆抗体的特点,特异性强，具有抗原结合位点的专一性。

不是抗原的专一性！） 因结合位点的单一性，有时不易捕捉抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应抗体的性质相同，容易纯化、标记2、多克隆抗体的特点,多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合的性质 特异性一般比单抗差 因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应比单抗更容易捕捉抗原因为含有抗不同表位的抗体，多种抗体都可与抗原结合抗体的纯化、标记比单抗难，因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别同时，血清中含有的杂蛋白比较多二、抗体的制备,1、单克隆抗体的制备 无法采用生物化学的方法从多抗中分离 必须采用细胞杂交的方法来制备 能否筛选到理想的单克隆抗体有技术问 题也有机遇问题,制备单克隆抗体的基本原理：,致敏的B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 （myeloma） （能够分泌特异性的抗体 ， （不能分泌特异性的抗体， 不能在体外长期生存 ） 但能在体外长期生存） 阳性杂交瘤细胞 (hybridoma) （既能分泌特异性抗体， 又能够在体外长期生存） 克隆化培养 （产生单克隆的阳性杂交瘤细胞） 生产单克隆抗体,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1,2,2,2,2,,,1,2,,脾脏细胞,骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,融合,2、多抗的制备 常用的免疫动物 免疫的基本步骤,,1）常用的免疫动物,兔子（rabbit）：最常用于自制抗体， 抗体量较多。

新西兰，大耳白） 小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但 抗体量很少BALB/C，昆明鼠） 大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过 程要麻醉动物Wistar大鼠）,,羊（sheep、goat）：常用于较大批量地 生产抗体（商品） 马（horse）：常用于大批量生产治疗用 抗体（商品） 豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用2）免疫的基本步骤,基础免疫：首次，抗原用量大，用弗式完全 佐剂（Complate Freund’ adjuvand ，含矿物油，卡介苗等） 加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用弗式不完全佐剂（Incomplate Freund’ adjuvand ，不含卡介苗）取血测效价： 加强免疫两次或三次以后的第7天取血 放血制备血清： 最后一次免疫后7-10天放血 （在三角瓶中加一些生理盐水，放血放置一段时间，凝固，吸取血清，离心，分装，冻存）,3) 如何免疫兔子,2000 g（雌雄均可），健康，无病原（小鼠20g，大鼠200g） 基础免疫 0.5 ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原) 0.5 ml弗式完全佐剂(CFA)（小鼠0.2ml） 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射（注意：不要剪毛）,加强免疫 间隔2-4周,可进行多次 0.5 ml抗原（蛋白量减半） 0.5 ml弗式不完全佐剂（IFA） 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射,免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价 酶联法：1:104以上，能达到1:106。

免疫双扩散： 1:16以上，能达到1:64 效价达到要求的可放血制备血清 可一次放血（颈动脉） 也可多次取血（耳静脉）,单抗与多抗的区别,单抗 多抗 抗体组成 单一 复杂 抗体性质 个体的属性 群体综合的性质 纯化标记 容易，效果好 难度高一些 种属来源 绝大多数是小鼠 兔子、羊、豚鼠等 制备周期 长 （最短4个月） 短（2个月） 制备技术 复杂 简单 经费 多 少,,,什么情况需要制备单抗,目的蛋白有结构类似物 抗原不纯，无法分开 多抗效果不好（已排除非特异性反应） 希望将抗体用于治疗，研制成药品 希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂,三、抗体的纯化,盐析法（硫酸铵沉淀） 辛酸-硫酸铵沉淀法 离子交换法 亲和层析法 凝胶过滤法,1、盐析法（硫酸铵沉淀）,原理 在高浓度中性盐存在下，蛋白质在水中的溶解度降低而产生沉淀 不同蛋白质的盐析常数不同 硫酸铵的加入量通常以饱和度表示 （100%饱和度：767 g/L）,主要步骤 在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀； 4℃高速离心，弃上清，溶解沉淀； 可反复操作，逐级降低硫酸铵的浓度: 50%饱和度： 0.313g/ml 45%饱和度： 0.277g/ml 40%饱和度： 0.243g/ml 最后一次离心后，用少量PBS溶解沉淀，透析， 测定浓度。

2、正辛酸-硫酸铵沉淀法,原理 两步沉淀： 先加正辛酸去杂蛋白 正辛酸是一种有机酸，在酸性条件下（pH4.5）可使大分子的杂蛋白沉淀 后加硫酸铵使抗体沉淀主要步骤： 调节样品的pH值，加入正辛酸（25 µl/ml），搅拌30分； 室温高速离心（10000g，30分钟），收集上清液； 再加入硫酸铵（40%饱和度）； 4℃高速离心（10000g，15分钟），弃上清； 溶解沉淀，透析，测定浓度3、离子交换法,原理 利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离 DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷 （Diethylaminoethyl，二乙氨基乙基） 将样品的pH值调至等电点以上，使样品带负电荷 采用盐溶液洗脱，通过高浓度的带同种电荷的离子(Cl-)置换被分离的组分.,,,,,,,,+,+,+,,,,,,,,,+,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,- - - - - - - -,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,带负电荷 的被吸附上,带负电荷少 的先被置换,带负电荷多 的后被置换,主要步骤 先用硫酸铵沉淀抗体，粗提； 将样品过柱； 洗去没有结合的物质； 用梯度NaCl溶液洗脱，等量收集洗脱液； 紫外分光光度计测量，保留A280值明显升高的样品； 汇集样品，浓缩，测定浓度。