《生物化学实验》教学课件—08-蛋白质与氨基酸的显色反应.pptx

生物化学实验技术生物化学实验技术蛋白质与氨基酸的呈色反应实验类型：验证性实验类型：验证性实验类型：验证性实验类型：验证性教学时数：教学时数：教学时数：教学时数：3 3生物化学实验技术一、实验目的学习鉴定蛋白质与氨基酸的方法及原理学习鉴定蛋白质与氨基酸的方法及原理生物化学实验技术二、实验原理（一）（一）双缩脲反应双缩脲反应 尿尿素素加加热热到到180左左右右，生生成成双双缩缩脲脲并并放放出出1分分子子NH3，双双缩缩脲脲在在碱碱性性环环境境中中能能与与Cu2+结结合合生成紫红色的化合物，此反应称为双缩脲反应生成紫红色的化合物，此反应称为双缩脲反应O=CNH2NH2O=CNH2NH2+O=CNHNH2O=CNH2C=OHNNH2C=ONH2Cu2+O=CNHNH2O=CNH2180NH3Cu2+OH-生物化学实验技术 蛋蛋白白质质分分子子中中有有肽肽键键，其其结结构构与与双双缩缩脲脲相相似似，也也能能发发生生此此反反应应此此法法可可用用于于蛋蛋白白质质的的定定性性或或定定量量测测定定因因此此，一一切切蛋蛋白白质质或或二二肽肽以以上上的的多多肽肽都都有有双双缩缩脲脲反反应应，但但有有双双缩缩脲脲反应的物质不一定都是多肽或蛋白质。

反应的物质不一定都是多肽或蛋白质生物化学实验技术（二）（二）茚三酮反应茚三酮反应 除除脯脯氨氨酸酸、羟羟脯脯氨氨酸酸与与茚茚三三酮酮反反应应生生成成黄黄色色物物质质外外，所所有有-氨氨基基酸酸及及一一切切蛋蛋白白质质都都能能和和茚茚三三酮酮反反应应生生成成紫紫色色物物质质，该该反反应应十十分分灵灵敏敏，目前广泛应用于氨基酸的定量测定目前广泛应用于氨基酸的定量测定生物化学实验技术（三）（三）黄色反应黄色反应 含有苯环结构的氨基酸，遇浓硝酸后，可含有苯环结构的氨基酸，遇浓硝酸后，可被硝化成黄色被硝化成黄色的硝基酚的硝基酚，该化合物在碱性溶液，该化合物在碱性溶液中进一步生成深橙色的硝醌酸钠多数蛋白质中进一步生成深橙色的硝醌酸钠多数蛋白质分子都含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应分子都含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应HO+HNO3(浓浓)HONO2HO=N-ONaOOH-生物化学实验技术三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、仪器：试管、试管夹、烧杯、酒精灯、石、仪器：试管、试管夹、烧杯、酒精灯、石棉网、三脚架棉网、三脚架2、试剂：尿素，、试剂：尿素，10%NaOH，1%CuSO4，2%卵清蛋白溶液，卵清蛋白溶液，0.5%Gly，0.3%Trp，0.3%Tyr，0.1%茚三酮水溶液，茚三酮水溶液，0.1%茚三酮茚三酮-乙醇溶液，乙醇溶液，0.5%苯酚溶液，浓硝酸。

苯酚溶液，浓硝酸生物化学实验技术四、实验内容四、实验内容（一）双缩脲反应（一）双缩脲反应1、取少量尿素放在干燥的试管中，用微火加热、取少量尿素放在干燥的试管中，用微火加热使尿素熔化，当熔化的尿素开始硬化时，停止使尿素熔化，当熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素释放出氨气，形成双缩脲冷却后，加热，尿素释放出氨气，形成双缩脲冷却后，加加10%的的NaOH溶液约溶液约1mL，振荡混匀，再加，振荡混匀，再加1%的的CuSO4溶液溶液1滴再振荡，观察出现粉红色滴再振荡，观察出现粉红色生物化学实验技术2、再取另一试管加卵清蛋白溶液约、再取另一试管加卵清蛋白溶液约1mL和和10%的的NaOH溶液约溶液约2mL，摇匀，再加，摇匀，再加1%的的CuSO4溶液溶液12滴再振荡，观察颜色变化，出现紫红色滴再振荡，观察颜色变化，出现紫红色示有蛋白质的存在示有蛋白质的存在生物化学实验技术（二）茚三酮反应（二）茚三酮反应1、取两支试管分别加入蛋白质溶液和、取两支试管分别加入蛋白质溶液和Gly溶液溶液各各1mL，再各加，再各加0.5 mL 0.1%茚三酮水溶液，混茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热匀，在沸水浴中加热12min，观察颜色由粉色，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝色。

变紫红色再变蓝色 2、在一小块滤纸上滴、在一小块滤纸上滴1滴滴0.5%的的Gly溶液，风溶液，风干后，再在原处滴干后，再在原处滴1滴滴0.1%茚三酮茚三酮-乙醇溶液，乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现生物化学实验技术（三）黄色反应（三）黄色反应1、向六个试管中分别按下表加入试剂，观察各、向六个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或微管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或微火加热，待各管出现黄色后，于室温下逐滴加火加热，待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入入10%NaOH溶液溶液至碱，观察颜色变化溶液溶液至碱，观察颜色变化生物化学实验技术管号123456材料卵清蛋白4滴头发少许指甲少许0.5%苯酚4滴0.3%Trp4滴0.3%Tyr4滴浓硝酸（滴）24040444现象10%NaOH将各管溶液滴至碱性为止（用pH试纸检查）现象。