冷冻电镜揭示生物大分子ppt课件.pptx

Unravelling biologicalUnravelling biological macromolecules with cryo macromolecules with cryo electron microscopyelectron microscopy 目 录 2 1 背景及简介 2 样品制备 3 优势 4 展望 1 背景及简介 3 冷冻电镜 Cryo microscopy 通常是在普通透射电镜上加 装样品冷冻设备 将样品冷却 后用于观测蛋白 生物切片的 设备 4 1 背景 发展历史 雅克 迪波什 Jacques Dubochet 约阿希姆 弗兰克 Joachim Frank 查理德 亨德森 Richard Henderson 发展了冷冻电子显微镜技术 以高分 辨率确定了溶液里的生物分子结构 6 当你冷冻水的时候 它常常形成冰 晶 有时候 这是六边形的晶体 有时 是立方的晶体 不透亮 但是 如果你非常迅速地冷冻液态 水 它可以形成无定形的冰 玻璃 态冰 起初 他们尝试了液氮 但是液氮温度通常都处于沸点附近 冷却表面形成大量气体 冷却速 度极慢 这会导致冷却之后常常得到冰晶 他设计了一个巧妙的方法 利用吸附的方式形成薄 的水膜 然后快速插入到冷却液体 处于液氮环境的液体乙烷 冷却至和液氮相当的温度 注 乙烷熔点约 183 C 液氮沸点约 196 C 速度 10000 C S 图像处理技术 7 可以把电镜下模糊的二维图像进行分析合并 从 而显示出一个清晰的三维图像和三维结构 1 背景及简介 8 冷冻电镜技术 让人类看的更细 9 主要应用 生物大分子及其复合物结构解析 细胞或者组织的超微结构解析 人眼分辨率 0 2mm 十分之一头发丝 光学显微镜 1000倍 电子显微镜 100倍 冷冻电镜 近原子级 1 背景及简介 10 X衍射晶体学 同一种蛋白质 的多个拷贝排 列成一个3D晶 体时 可以通 过X射线衍射实 验获得关于蛋 白质的原子结 构的信息 核磁共振光谱 NMR 测量原子之间 的距离依赖相 互作用 可以 用来推断相对 小的蛋白质的 结构 并且它 提供了关于蛋 白质动力学及 其与其他分子 相互作用的独 特信息 冷冻电子显微技术 蛋白质散射电子的 强度比X射线大一 万倍 而电子可以 通过几十万伏的电 场加速到比蛋白质 结构中原子间距离 短得多的波长 此 外 电子的电荷使 得相对容易用电磁 透镜聚焦它们 一般电镜技术在生物领域应用制约因素 11 1 生物样品含有丰富的水分 而投射电镜工作的条件是高度真 空环境 2 高能电子束会对样品造成破坏 电压一般为300kV 200kV 120kV 3 生物样品主要组分是碳 氢 氧等轻元素 对电子的反射和 散射作用与背景相比效果相似 所获图像衬度低 4 观察过程中蛋白质与电子发生相互作用或者由于温度变化而 发生漂移 导致模糊 12 辐射损伤意味着穿过样品的电子将破坏其化学键 改 变原有结构信息 比如蛋白 脂等等 将它们 烧 掉 所以 氢键会被破坏 变成了气体 留下的只 有一些结构残骸 由于辐射损伤的存在 无法测定单个分子 的结构 所以他提出使用晶体 通过这种 方式 你可以弄清楚电子是如何和这些结 构相互作用 这种情况下 你就拥有数十 万个规则排列的分子 即使其中的一部分 子结构被破坏 你也可以从中得到目标分 子的结构信息 膜蛋白 13 去除糖基化 长环和 柔性区域 洗涤剂优化 gua 14 谷氨酸脱氢酶 2 样品的制备 15 将几微升纯化的蛋白质溶液 施加到由多孔碳膜组成的网格上 并将多余的液体吸干 栅格 插入液体乙烷 瞬间冻结样品和 嵌入颗粒玻璃冰 电网储存在液 氮中直到它被转移到透射电子显 微镜 网格孔内各种方向的蛋 白质的二维图像然后被显微镜的 检测器捕获 处理数据以将相 同蛋白质的图像组合成蛋白质结 构的3D重建 3 3D重建 16 3D重建最简单的一种方法 单颗粒 法 以核 糖体为例 核糖体冷冻在一个很薄的水膜中 我们可以从各个不同方向看到的核糖体的二维 投影图 从照片中挑选出一个一个核糖体的 单颗粒 如果数量足够 比如目前大约需要1 2万个 你就可以将这些各个不同方向的核糖 体信息组合 模拟得到三维结构 采集过程 17 分子随机冷冻在某个状态 单颗粒冷冻 分辨率达到2 9 0 29nm 18 优势 1 不需要结晶 2 样品保存在天然环境 3 可以研究亚稳态结构 4 样品量少 1 L 蛋白分子需要120kd以上 二聚体的话60kd也可以考虑 20 冷冻电镜在动力学中的应用 21 ATP合成酶 包含不同构象的 大分子混合物 展望 22 1 引进云计算 冷冻电镜需要采集大量数据 以 核糖体为例 我们将核糖体冻在一个很薄的水膜 中 能从各个不同方向看到的核糖体的二维投影 从照片中挑出一个一个核糖体的 单颗粒 按 之前我们说的要获得它的一个三维结构 目前需 要1 2万个 2 用于揭示某些疾病的生理过程 神经变性疾病为例 PHDD疾病基因 加上绿色荧光蛋白基 因 然后将这个报告基因转染细胞系 通过绿色荧光蛋白确定致病蛋白 利用冷冻电镜观察致病蛋白的结构 发 现其是一个表面带有刺状结构的蛋白 与正常的蛋白比较发现神经元内的内质 网的一个膜破碎没有了 从这种结构性 变化角度去认识神经细胞的死亡过程 Thank you 25 亚稳态 如果体系能量高于平衡态时的自由能 则是一种非平 衡状态 。