黄老师3版-基因工程教学文稿.ppt

1第二十一章基因工程生物化学与分子生物学黄诒森主编2将一种生物的基因与载体分子在体外进行拼接重组，转入另一生物体细胞内使之扩增并表达新的性状是生物技术领域的核心技术基因工程geneticengineering供体、受体、载体是DNA重组技术的三大基本元件 在体外将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接成一个新的DNA分子以获得单一基因或DNA片段的大量拷贝为目的，故称为基因克隆或分子克隆DNA重组DNArecombination3基因工程geneticengineering广义：包括两大部分上游技术:外源基因的克隆、重组、表达的设计与构建（即狭义的基因工程或重组DNA技术）下游技术:含外源基因的重组菌或细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化与鉴定等工艺蛋白质工程（proteinengineering）：利用克隆基因表达、制备特定的蛋白质或多肽，或定向改造基因结构获得新的蛋白质或蛋白质的新性质5第一节基因克隆的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别识别 特异序列，切割DNADNA连连接酶催化DNA中相邻邻的5磷酸基和3羟羟基末端之间间形成磷酸二酯键酯键 ，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连连接DNA聚合酶合成双链链cDNA分子或片段连连接；缺口平移制作高比活探针针；DNA序列分析；填补补3末端Klenow片段（DNA聚合酶I大片段）具有53聚合、35外切活性，无53外切活性。

常用于cDNA第二链链合成，双链链DNA3末端标记标记 等逆转录转录 酶合成cDNA；替代DNA聚合酶I进进行填补补，标记标记 或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟羟基末端磷酸化，或标记标记 探针针末端转转移酶在3羟羟基末端进进行同质质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基6一、限制性核酸内切酶restriction endonuclease 一类能识别双链DNA分子内部的特异序列，并在识别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶 存在于多种细菌中，与相伴的甲基化酶共同构成细菌的“限制-修饰”体系，保护自身DNA，分解外来DNA 维持细菌遗传性状的稳定遗传一）概念基因工程的手术刀7命名基本原则：3-4个字母组成:属名+种名+株名+序号如：EcoR:EscherichiacoliR(大肠杆菌R株)=Escherichia，埃希菌属 细菌属名第一个字母，co=coli，大肠杆菌菌种 细菌种名头二个字母，R= RY13 细菌株名头一个字母，I=第一个分离到的内切酶 酶被发现的先后顺序 （二）命名与分类8 分类 I类：分子量大，识别位点复杂，特异性差类类：分子量小，识别位点与切割位点特异、固定，切割作用发生在识别位点范围内。

识别序列4-6个碱基对，具有回文结构类类：分子量大，酶活性不单一，如EcoP1 根据酶的结构、所需因子及裂解DNA方式的不同可分为 I、II、III类限制性核酸内切酶9两种切割方式：错位切，垂直切 黏端切口、平端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平头/钝性末端(blunt end)黏性末端(sticky end,Cohesive end)10Bam H限制性核酸内切酶切割限制性核酸内切酶切割DNADNA均产生均产生5-5-磷酸基磷酸基和和3-OH3-OH的末端的末端基因工程的手术刀GGATCCCCTAGG5533+-OHGCCTAG53-PGATCC GP-53HO-11EcoREcoR的识别序列的识别序列EcoR的切割位点5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C55G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C5 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C5OH POHPEcoR切割产生5粘性末端位点EcoR,37C退火，4-7C5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C55G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G33C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C5 5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5OH POHPPst切割产生3粘性末端位点Pst37C退火4-7C5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C55G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C5 Pvu产生的平头末端Pvu，37C155-粘性末端3粘性末端平末端酶识别识别 序列酶识别识别 序列酶识别识别 序列TaqIT/CGAPstICTGCA/GAluIAG/CTCla IAT/CGATSacIGAGCT/CFnuDCG/CGMboI/GATCSphIGCATG/CDpnIGA/TCBglA/GATCTBde IGGCGC/CHaeGG/CCBamHIG/GATCCApaIGGGCC/CPvu CAG/CTGBclIT/GATCAKpnIGGTAC/CSmaICCC/GGCHindA/AGCTTNaeIGCC/GGCNcoIC/CATGGHpaIGTT/AACXmaIC/CCGGGNruITCG/CGAXhoIC/TCGAGBalITGG/CCAEcoRIG/AATTCMstITGC/GCASalIG/TCGACMhaTTT/AAAXba IT/CTAGAEcoRGAT/ATC某些限制性内切酶及产生的末端16二、其他工具酶（二）DNA聚合酶1.DNA聚合酶 大肠埃希菌DNA聚合酶是单一肽链的多功能酶，928个氨基酸。

有3个相对独立的活性中心，分别具有53聚合酶活性，35和53核酸外切酶活性 Klenow片段（大片段）指羧基末端604个氨基酸，保留53聚合酶活性，也有35核酸外切酶活性17Klenow片段是分子生物学研究的常用工具用途：合成cDNA的第二条链修复DNA片段3末端（校对活性）标记探针3末端DNA序列分析182.Taq-DNA聚合酶(Taq酶) 耐热的聚合酶，具有53聚合酶活性和53核酸外切酶活性，热稳定性好，最佳温度70-80，PCR中最常用,无35外切酶活性，无校正功能193.逆转录酶 依赖RNA的DNA聚合酶，合成互补DNA（complementary DNA，cDNA）功能： 逆转录作用： 53合成cDNA单链 核酸酶H的水解作用： 35水解杂化双链中的RNA 依赖DNA的DNA聚合酶作用：以杂化双链中的DNA为模板，催化合成cDNA的互补链204.末端转移酶（TDT） 末端脱氧核苷酰转移酶，不需要模板的DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到单、双链DNA分子的3-OH上，用于标记探针和构建黏性末端211.DNA连接酶（DNA ligase） 一种封闭DNA链上缺口的酶，催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端形成磷酸二酯键。

大肠杆菌DNA连接酶：在DNA聚合酶1催化聚合填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的单链缺口，在DNA复制、修复和重组中起作用辅基为NAD+T4连接酶：连接双链DNA分子的黏性末端或平末端需ATP二）DNA连接酶22（三）碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase） 切除核酸末端的5-磷酸基团可有效防止载体自身磷酸化，提高重组效率23（四）核酸酶S1一种高度单链特异的核酸内切酶功能： 单链水解功能，作用于双链核酸分子的单链区，并从单链部位切断核酸分子，单链区可以小到只有一个碱基对的程度 用于分析核酸杂交分子(RNA-DNA)的结构、给RNA分子定位、去除DNA片段中突出的单链尾产生平端、打开在双链cDNA合成期间形成的发夹环24载体： 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA第二节基因克隆的载体25 能稳定自主复制，有较高拷贝数； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 分子量小，以容纳较大的外源DNA载体的选择标准天然质粒、噬菌体、病毒需经人工改构才可用作载体26 克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。

表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体载体的分类穿梭载体：含有原核和真核细胞的复制元件27 存在于细菌中、独立于染色体、能自主复制的双链环状DNA分子1. 质粒(plasmid) 一、克隆载体分2类：严格控制型：复制与宿主的繁殖偶联，拷贝数少松弛控制型：复制与宿主的繁殖不偶联，拷贝数多多克隆位点选择性基因复制起点28优点：分子量小易提取，有耐药性标志易导入宿主缺点：插入的外援基因不超过10kbpBR322物理图谱29pUC18质粒物理图谱大肠埃希菌克隆载体pUC系列质粒，有氨苄西林抗性基因和大肠埃希菌Laz基因30（1）噬菌体：双链线性DNA,两端有互补单链黏性末端（cos位点）2. 噬菌体(phage) 感染细菌的一类病毒噬菌体DNA必须包装蛋白质外壳并成熟后才能感染细菌感染时，噬菌体DNA进入大肠埃希菌，其黏性末端环化成环状双链DNA31野生型噬菌体DNA及相应的噬菌体DNA图谱321.gt系列（插入型，插入片段6 kb，克隆效率高，适用于cDNA克隆， gt 10为代表，有EcoR I但一位点）2.EMBL系列（取代型，插入片段可达20 kb，适用于大片段基因组克隆，有BamH I、 EcoR I 和Sal位点）3.黏性质粒（cosmid）（由DNA的cos区与质粒重构而成的双链环状DNA载体，既有质粒特点，又能像噬菌体一样体外包装。

克隆容量大，达40-50kb，用于构建基因组文库）人工改造噬菌体33（2）M13噬菌体：DNA改造系统：序列排列紧密，改建仅限于基因之间作插入区M13mp系列（插入E.Coli的基因片段含lacZ的基因）pUC系列 (利用pBR322和M13载载体的优优点构建) 单链闭环状DNAM13感染宿主菌后在菌体内酶的作用下，以感染性单链DNA为模板，复制转变为双链DNA，称为复制型（RFDNA）；达到一定拷贝时停止复制，产生大量单链DNA并包装34（三）病毒载体 能感染动物细胞的病毒，可满足真核DNA 重组生物需要用于对肿瘤和遗传病的研究和治疗常用的病毒载体：猿猴空泡病毒（SV40）逆转录病毒（retrovirus）昆虫杆状病毒腺病毒（Adenovirus,AV）腺相关病毒（Adeno-associatedvirus,AAV）SV4035病毒载体构建时把细菌质粒复制起始点放置其中改建后的病毒，含病毒启动子、包装元件、遗传标记和质粒复制起始点36二、表达载体用于在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体必须具备克隆载体的性质必须带有转录和翻译所必需的元件对不同的表达系统要构建不同的表达载体1.原核表达载体常用大肠埃希菌表达载体。

在克隆载体基础上还含有启动子（trc启动子、T7噬菌体启动子等）、核糖体结合位点（RBS）、转录终止序列等37uSV40病毒载体：最终导致宿主细胞死亡，使用受限u逆转录病毒载体：较高的整合和表达外源基因能力，要考虑安全性u腺病毒载体：第三代去除所有腺病毒的编码基因，已用于基因治疗uAVV载体：细小的DNA病毒无致病性，感染效率高，在基因治疗中广泛使用2.真核表达载体由克隆载体发展而来，包括原核生物的序列、真核表达调控的元件（启动子、增强子、转录终止、加polyA信号序列）、真核细胞的复制起始序列、真核筛选标志基因等38第三节基。