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Ⅰ、毛细管电泳及其应用The Application of Capillary Electrophoresis （CE）一、毛细管电泳的概述：毛细管电泳又称高效毛细管电泳，它是在熔融的石英毛细管（内径为25~100mm）中进行电泳，其管内填充缓冲液或凝胶，是近年来进展最快的分析方法之一毛细管电泳是电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，它具有效率更高、速度更快、样品和试剂消耗量特少的特性毛细管电泳仪的基本结构：1、 高压电极槽与进样机构 2、填灌清洗机构 3、毛细管 4、检测器 5、铂丝电极 6、低压电极槽 7、恒温机构 8、记录/数据处理毛细管的结构：毛细管电泳通常使用内径为25~100μm的弹性（聚酰亚胺）涂层熔融石英管毛细管的特点是：容积小；侧面/截面积大而散热快、可承受高电场；可使用自由溶液、凝胶等为支持介质；在溶液介质下能产生平面形状的电渗流二、毛细管电泳的基本原理：毛细管电泳是以高压电场（30kV）为驱动力，以毛细管为分离通道其管内填充了缓冲液或凝胶，根据样品中各组分之间淌度和分配的差异而实现分离的一类液相分离技术在电泳过程中，毛细管两端插入电极液，此电极液通常与管中的缓冲液一致。

正负电极连接至高电压装置，进样时样品盘移动，使毛细管的进样端及此端的电极准确插入样品管中，给予一定电场或压力后，样品被吸入毛细管内，然后再将毛细管移至电极液中开始电泳在毛细管电泳中，为了维持电荷平衡，溶液中的正离子吸附至石英表面形成双电子层，当在毛细管两端施加电压后，这层正离子趋向负极移动，并带动毛细管中的溶液以液流形式移向负极（电渗） 由于毛细管的表面积与体积比大，加上电泳时使用了高压，电渗在毛细管电泳中具有两大特点：液体沿着毛细管壁均匀流动，其前沿是平的；携带不同电荷的分子朝一个方向移动，中性分子也能随着电渗一起移动而实现分离三、毛细管电泳的检测技术：迄今为止，毛细管电泳常用的检测方法有：紫外-可见光吸收、荧光、电化学、质谱、激光诱导荧光检测等四、毛细管电泳的分离模式：（一）毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE ）：毛细管和电极槽内充有相同组分和相同浓度的电解质溶液（缓冲液）它是最基本、应用最普遍的一种分离模式，尤其对于亲水多肽的分离具有一定的优越性二）微团电动毛细管色谱（micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC）：通常有一些离子型表面活性剂（如SDS）加到缓冲液中，这类分子一端为亲水基团，其余部分为疏水内核，亲水基团在表面，中性粒子因其本身疏水性不同而得以分离。

三）毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing，CIEF）：选用内壁中性共价涂层消除电渗的毛细管，利用两性电解质形成pH梯度CIEF具有较高的分辨力四）毛细管筛分电泳（capillary sieving electrophoresis，CSE）：在毛细管内填充了多聚物作为分离介质，如甲基纤维素对分子的泳动起着阻碍作用其作用机制类似平板电泳凝胶的筛网作用，大分子较小分子所受的阻碍大，泳动速度减慢五）非水毛细管电泳（nonaqueous capillary electrophoresis，NACE）：利用纯有机溶剂（甲酰胺及其衍生物、乙腈、醋酸、甲醇、二甲亚砜等）或混合试剂替代水介质来完成样品的电泳分析NACE主要用于分析不易溶于水而易溶于有机溶剂的物质，分离在水溶剂中淌度十分相似的物质，研究在水中难以发生的反应等六）毛细管阵列电泳（capillary array electrophoresis，CAE）：CAE是在常规CE原理和技术的基础上，结合微型制造技术设计出来的一种检测技术由微通道或反应池等构成通道型微阵列芯片，通过加载生物样品，进行一种或连续多种反应，达到快速高效分析的目的，是一种新型的生物芯片。

七）免疫亲和毛细管电泳（immunoaffinity capillary electrophoresis，ACE）：ACE是把蛋白质（抗原或抗体）事先固定在毛细管柱内，利用抗原-抗体的特异性识别反应，CE的高效、快速分离能力，LIF的高灵敏度来分离检测样品混合物中能与固定化蛋白质特异结合的组分五、影响毛细管电泳分析精密度的因素：积分软件的影响冲洗程序的影响温度控制的影响进样的影响 六、应用：（一）CE快速PCR-SSCP分析：DNA单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）是一种有效的检测DNA变异的技术，原理是不同的单链DNA分子在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率与其构象密切相关，而每一DNA分子的构象又是由其特异的碱基序列决定的，一个碱基的改变都有可能影响其构象，从而引起其电泳行为的改变。

传统的SSCP分析采用平板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），显示电泳结果必须辅以放射自显影或硝酸银染色等技术，费时费力，不能满足临床检测基因点突变的需要毛细管电泳技术具有快速、高效、样品消耗少等特点希望利用人工诱变的含有单个核苷酸改变的PCR产物，建立和优化CE作SSCP分析的方法与条件，为临床基因诊断提供一种快速有效的筛查方法A未变性的标准分子量DNA B变性后的标准分子量DNAPCR样品的毛细管电泳图谱：（二）凝集素碎片的糖结合活性：利用毛细管电泳技术研究植物凝集素的活性肽段和拟糖蛋白的结合能力BPA：羊蹄甲凝集素，对半乳糖专一LCA：小扁豆凝集素，对葡萄糖/甘露糖专一BPA-10： BPA的活性碎片（10肽）LCA-9：LCA的活性碎片（9肽）拟糖蛋白：半乳糖牛血清白蛋白（Gal-BSA）甘露糖牛血清白蛋白（Man-BSA）L-岩藻糖牛血清白蛋白（L-Fuc-BSA）结合反应：肽溶液和拟糖蛋白溶液等体积混合后，室温放置过夜A：BPA-10 B：BPA-10和Gal-BSA的混合物 C：BPA-10和Man-BSA的混合物 A：LCA-9B：LCA-9和Gal-BSA的混合物C：LCA-9和Man-BSA的混合物D：LCA-9和L-Fuc-BSA的混合物Ⅱ、核酸分子杂交第一节 分子杂交的概念及基本原理主要内容：一、分子杂交的概念二、分子杂交基本原理（一）DNA变性：1、DNA变性的方法， 2、增色效应， 3、溶解曲线，4、融解温度， 5、影响Tm值的因素。

二）复性：退火一、分子杂交的概念：分子杂交（molecular hybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列二、分子杂交基本原理：（一）DNA变性 ：DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等） 1、DNA变性的方法：1)加热；2)改变DNA溶液的pH；3)有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素2、增色效应：DNA在260nm处有最大吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect） 利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程3、溶解曲线：如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。

4、融解温度：通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature， Tm）因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度5、影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：1) 部因素：pH、离子强度随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大2) 部因素：DNA的碱基比例、DNA的均一性 ；在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高6、DNA中的GC含量与Tm值关系：Tm = 6941 % （G+C） 对于小于20bp的寡核苷酸，Tm=4（G+C）+2（A+T） 实验表明DNA分子中（G+C）克分子含量百分比的大小与Tm值的高低呈直线关系二）复性：变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation） 退火：通常DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低25～30℃左右时，变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。