分子生物学技术在食源性微生物检测中的应用

1、分子生物学技术在食源性微生物检测中的应用(浙江大学生物系统工程与食品科学学院 胡竞进 11513021)摘要：食源性微生物污染是食品安全中最突出的问题之一,对人们的健康有着深远的影响。然而，传统的食源性微生物检测方法繁琐复杂、周期较长, 因此以分子生物学技术为代表的快速、简便、特异的检测方法成为研究的热点。本文介绍了以聚合酶链式反应、基因探针检测法、变形梯度凝胶电泳、基因芯片、随机引物扩增多态性等分子生物学技术在食源性微生物检测中的应用，为今后进一步研究和开发新检测技术提供一些参考。关键词：食源性微生物；分子生物学技术；聚合酶链式反应；基因探针；变性梯度凝胶电泳；基因芯片；随机引物扩增多态性Application of molecular biotechnology in foodborne microorganisms detectionCollege of Biosystems engineering and Food Science 11513021 JingJin HuAbstract: The pollution caused by foodborne microorgani

2、sms is one of the most dominant issue for food safety, which has deeply affected the public health.However, traditional methods for detection of food borne pathogens are quite complex, and cost much time, so increasing number researches focus on the quick, convenient and differential methods such as molecular biotechnology. This article introduced several molecular biotechnology which commonly used in detection of food microorganisms including polymerase chain reaction (PCR), gene probe , denatu

3、ring gradient gel electrophoresis (DGGE), gene chip , random amplified polymorphism DNA (RAPD), aiming to provide a reference for the further study.Key words: foodborne microorganisms; molecular biotechnology; PCR; gene probe ; DGGE; gene chip ; RAPD微生物污染是诸多食品安全问题中最突出的环节之一，一方面因为微生物个体小、生长快、分布广、种类多，易于在食品生产、运输、销售过程中造成污染；另一方面，微生物在污染食品后其菌体本身以及产生的毒素等代谢产物会对食品本身造成品质的破坏使其失去使用价值造成经济损失，并会对误食者造成健康上的损害甚至生命的威胁。据世界卫生组织(WHO)统计,全世界每年发生食源性疾病数十亿人,甚至在发达国家,也有三分之一的人群每年遭受食源性致病菌的侵袭。因此，食品微生物检测对于保障食品安全起着及其重要的作用。传统的食源性微生物

4、检测和鉴定方法主要有分离培养鉴定法、生化鉴定、酶联免疫吸附法(ELISA)及自动酶联荧光免疫检测方法、电阻抗测量法、放射测量法、生物发光法、直接外荧光过滤技术、色法等物理和化学的方法。传统的微生物检测方法虽然有效，但存在速度慢、成本高、效率低等问题,例如，需要5一7天的培养鉴定时间,不能实现快速检测；微生物的生化特征以及生化试剂的不稳定,经常鉴定的结果不准确、重复性差。因此，传统的检测方法越来越难以满足现代社会快速检测的要求。随着细菌基因组学和分子生物学技术的飞速发展，诞生了许多准确度和灵敏度高、特异性强、操作简便、检测周期短、效率高的分子生物学技术，它们越来越广泛地应用于食源性微生物的检测。本文对在食品病原微生物检测中常用的几种分子生物学技术原理及应用。1聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction，PCR）美国人 Mullis于1985年发明了PCR技术，并荣获了1993年诺贝尔化学奖。PCR现在已成为生命科学领域最常用的分子生物学技术之一，它是一种体外酶促合成DNA 片段方法，由变性、退火和延伸等几步反应组成一个循环，重复进行，最终使目的DNA 以指数级迅

5、速扩增。常规PCR反应体系中包括模板、引物、Taq DNA聚合酶、 dNTP、 Mg2 + 及缓冲液等成分。与传统的微生物检测方法相比，PC具有以下特点:(1)灵敏度高:病毒检测的灵敏度可达3 个 RFU，细菌检测的最小检出率为3个细菌；(2)特异性强:对不同微生物型进行准确鉴定； (3) 操作简便省时:一般12 h就可完成检测。1.1多重 PCR多重 PCR 又称多重引物 PCR，其基本原理和操作程序与常规 PCR 相同，只是在反应体系中加入多对特异性的引物, 可同时检出多种致病菌或对同一致病菌的多个亚型进行分类，也可以通过检测微生物的致病性基因判断微生物的致病性。多重 PCR 可以显著提高检测效率和降低检测成本，在食品、药品微生物检测领域得到了广泛的应用。卫沛楠等建立的针对金黄色葡萄球菌9种肠毒素的多重PCR方法检快速、简便，且特异性较高，较传统方法有明显的优势1；滕要辉等建立的多重 PCR 方法经过 4 h 的增菌培养即可从速冻水饺中同时检出起始菌数 100 CFUg-1的沙门菌和金黄色葡萄球菌，且特异性为100%2；张政等用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌 DNA 作为模

6、版建立多重 PCR 方法，在 6 h 内即可完成检测，检出限达到 104 CFUmL-1 3；强世龙等根据副溶血性弧菌tdh、tl基因设计引物用双重PCR技术快速检测新鲜海水贝类样品中副溶血性弧菌，该方法的最低检出限为2.5102cfu/mL，模拟污染样品的检测限为10cfu/g，且与国家标准方法的检测结果一致4；杨平等针对食品中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和单增李斯特菌建立的多重PCR检测方法，只需经过48h增菌即可检测，最低检出限可达1cfumL 5；Yang等基于多重PCR建立了对食品中鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157： H7和单增李斯特菌的快速检测方法，其纯菌落的检测限分别达1.2102 cuf/mL、4.0102cuf/mL 和5.4102cuf/mL）6；范宏英等运用多重PCR技术成功的建立了沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157、 绿脓杆菌和副溶血弧菌5种饮用水中致病菌的同时快速方法7。与传统检测方法相比，多重 PCR检测法大大缩短了检测时间和样品量，同时提高了结果的准确性和可重复性。1.2免疫捕获 PCR(immuno-capture PCR，IM-PCR)

7、IM-PCR 技术是一种把抗原抗体反应和PCR技术相结合、用于检测微量抗原的新技术, 由抗原抗体的免疫反应和常规的 PCR 反应组成。该技术既保留了抗原抗体反应的特异性，又应用了 PCR 技术的高度灵敏性, 具有高度特异性、快速检测、易于操作、成本低廉等优点。夏俊芳等应用免疫捕获 PCR方法特异性的检测了2 株金黄色葡萄球菌，且在对 5 种食品模拟带菌检测时发现，该方法无需培养，检测的灵敏度可达到 2.35103 CFUmL-1，是常规 PCR 检测灵敏度的 100 倍8。1.3实时荧光定量PCR (real-time PCR)常规的 PCR很难根据 PCR 的扩增终产物计算起始模板的拷贝数，即无法对初始模版进行定量分析。而荧光定量 PCR 技术(real-time quantitative PCR，RT-PCR)在反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累对整个PCR全过程进行实时监测，通过标准曲线可对未知模板起始浓度进行定量。高正琴等建立的特异性检查支原体的 TaqMan 探针实时荧光定量 PCR 方法，检测灵敏度达 9.2 拷贝，且与空肠弯曲菌、肺炎克雷伯杆菌等 8 种细菌均无交

8、叉反应，为动物源性药品和生物制品中支原体的快速检测提供了实用的方法9；Herbel 等利用荧光定量PCR 技术特异性检测出酸奶中乳酸杆菌的浓度为105 CFUmL-1，能够完全满足商品中益生菌浓度检测的需要(通常检测范围为 1061012 CFUmL-1) 10；徐杨等用鲍鱼管家基因16S rRNA基因设计特异性引物和探针，建立的鲍鱼过敏源基因成分实时荧光PCR快速检测方法具有良好的特异性和灵敏度11；刘继超等 以SED基因为肠毒素D的检测靶序列，设计荧光定量PCR引物和TaqMan探针，建立了TaqMan探针荧光定量PCR方法对乳中产肠毒素D金黄色葡萄球菌进行快速检测，具有良好的应用前景12；2010年,程晓燕等建立的SYBR Green I 实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒的方法,取得了较好的实现效果13。2基因探针检测方法华盛顿卡内基学院的 Britten 等于1968年利用碱基配对原理使互补的 2 条核酸单链通过退火形成双链创建了基因探针技术，又称核酸分子杂交技术。基因探针技术是现代DNA分析方法的基础，已经广泛应用于食品微生物的检测中，能排除非致病性微生物的干扰，灵敏

9、、快速、直接地检测出致病性微生物14,16 。通过分离和标记病原体独特的核酸片段就可制备出探针，利用带有标记物的已知序列的核酸探针与待测样品进行杂交，最后使用特定的方法测定标记物，便可确定样品中有无特定病原体。Moseley 等用生物素标记沙门菌基因片段制作探针检测食品中的沙门菌取得了良好的效果； Kerdahi 等使用自动化酶连接的非放射性 DNA 探针，迅速准确地检测出了单核细胞增生李斯特菌17； 陈倩等使用针对 ESIEC 大肠杆菌 HPI毒力岛基因设计的 rpz 探针，成功地鉴定出了 ESIEC 大肠杆菌18。此外，商品化的基因探针试剂盒也已经问世，例如：美国 GENETRAK 公司研制出了脱氧核糖核酸杂交筛选比色法，主要利用特异的基因探针对沙门菌、 李斯特菌和大肠杆菌的 rRNA 进行检测；法国梅里埃公司研制的 GENEPROBE系统采用杂交保护分析法对食品中的金黄色葡萄球菌进行检测19。目前已可以用 DNA 探针检测食品中的大肠杆菌(Escherichia coli) 20、沙门氏菌( Salmonella) 21、志 贺 氏 菌 (Shigella spp ) （Bei A K , Dicesare J C , Haff L .Appl .Envi ro n . M icrobiol. , 1991 ( 57 ) : 1013 1017）、耶希 氏菌( Yersinia enterocolitica) 22、李斯特菌(Listeria monocytogenes) 23、金黄 色葡萄 球菌( Staphylococcus aureus) 24等。 Wang 等对用 DNA 探针杂交技术检测食品中 13 种常见的致病菌的一般方法进行了概述25。基因探针检测技术不仅具有特异性、灵敏度高的优点，而且兼备组织化学染色的可见性和定位性。目前核酸探针在食品微生物检测中主要应用于以下几个方面：（1）检测无法培养或无法生化鉴定、产物不可观察的微生物以及诊断抗原缺乏病原体的检测。（2）用于检测病毒。（3）用于流行病学调查研究，区分

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