pcr实验注意事项
5页1、实验中的一些好习惯加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性一定要记着关水浴箱,切记切记多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎是最快提高的捷径了所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22m滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
2、它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应,因而 含T
3、ris和DTT的试剂不能用DEPC处理(一)动植物总RNA提取-Trizol法 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A) 分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。 3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。 4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4下7500g离心5分钟。5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55-60水溶 10分钟。R
4、NA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70。注意 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。另外,提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要,要不然会有蛋白质污染,影响比值2、加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周,-20保存一年。总mRNA的提取(自己的经验)一、 关于Trizol Reagent需要的试剂1 Chloroform:氯仿 (分析纯)2 Isoproplyl alcohol:异丙醇(分析纯)3 75% Ethanol(in DEPC-treated water):75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。4 RNase-free water:无Rnase的水。方法是:将DEPC按0.01%(V/V)加在d H2O中500ml(50ul),在37过夜,并高压灭菌即得(150 3小时)5 一次性塑料手套6 注意:DEPC有致癌之嫌二、 关于Trizol Reagent的使用过程:1 Homogenization(匀浆)a. Tissues:组织每100
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