WHO推荐Xpert-MTB-RIF全文-20131105

1、结核诊断和实验室服务 参考便览简介 照顾结核患者从正确诊断开始。成功的现代结核病控制策略的开展，以及对耐药和人类免疫缺陷病毒相关结核的系统性管理，其核心，是需要一个有足够生物安全、现代化的诊断方法、标准操作规程和合适质量保证的结核实验室稳健网络。可以说作为卫生系统最薄弱的环节，实验室服务历来被严重忽视，人员不足，并且资金短缺。因此诊断能力成为提升管理和控制耐药结核及人类免疫缺陷病毒（HIV）相关结核的一大瓶颈，这主要是由于：政策变化和技术转移进展缓慢，尤其是在低收入和中等收入国家；实验室改进计划不充分，资金不足；实验室基础设施和生物安全不完善；技术熟练的员工数量非常欠缺；技术支持不充分。结核的实验室诊断，作为卫生系统的一项重要工作，它的加强是实验室整体水平提升的最佳手段之一。这一活动是基于国家一级的结核控制项目和公共卫生实验室服务之间的合作，在综合战略和国家实验室强化计划中，提供足够的实验室能力包括一些基本要素，保证可以同时运行。一项前所未有的致力于改善和扩大结核实验室能力的努力，目前正在进行中，由世界卫生组织和遏制结核伙伴关系的全球实验室倡议（GLI）及其国际合作者网络(http:/

2、www.stoptb.org/wg/gli)牵头。同时新的结核诊断技术的研发正在加速，并且诊断途径正在迅速发展1。基因型 (分子) 分析方法在扩大规划性管理和耐药结核病监测中有相当大的优势，可以提供快速的诊断，标准化的测试，潜在的高通量，并且对实验室生物安全要求较低。GeneXpert平台Xpert MTB/RIF试验的开发在2009年完成，它被认为是与结核斗争中的一个重要突破。这是第一次，可以把一个简单并强大的分子检测引入传统的实验室配置。这个试验能用痰标本在2小时内直接获得结果。 世界卫生组织有证据确凿的数据支持广泛应用Xpert MTB-RIF来诊断结核和利福平耐药结核。因此建议：1）对疑似多耐结核或HIV相关结核患者的最初诊断应采用Xpert MTB/RIF试验，而不是传统的显微镜检查、培养和药敏试验（强烈推荐）；2）在多耐结核和/或HIV低发地区，Xpert MTB/RIF试验可作为镜检的后续试验，特别是涂片阴性的标本（非强制性建议，承认主要是资源的影响）。然而，Xpert MTB/RIF试验并没有替代对传统的显微镜检查、培养和药敏试验的需要，这些传统试验仍被用于监测治疗进展

3、和检测利福平以外的药物耐药。 对结核进行床旁检测可能需要等到2015年之后；因此，现有的世界卫生组织推荐的技术必须加速吸收，这需要在国家层面上对结核筛查和诊断提供足够的实验室设施和明确的政策。由于实验室加强的复杂性，建议在国家层面上有专业的实验室顾问在执行过程中进行指导。在适当的实验室服务中使用的技术 建立、配备和维护实验室网络是具有挑战性、复杂和昂贵的事情。如果实验室服务的所有核心要素不能同时具备，那么引进新技术注定要失败。这些要素包括： 实验室基础设施，适当的生物安全措施和维护；设备验证和维护；标本运输和转诊机制；实验室的物资管理；实验室信息和数据管理系统；实验室质量管理系统；适当的、充足的策略和基金用于实验室人力资源的开发。GLI已经开发出了一种在国家实验室战略计划内的，适当的实验室服务范围内，旨在确保结核诊断质量的加强结核实验室的路线图2，详见网站http:/www.who.int/tb/dots/laboratory/policy/en. 实验室生物安全结核分枝杆菌是一种生物危险三级病原体，但是根据采用的检测方法不同，标本处理具有不同的风险。对在结核实验室进行的不同技术程序采

4、用以风险为基础的评估，可以使最低要求的实验室设施的发展成为可能。风险评估方法考虑到实验室的细菌负荷（标本数量，培养数量），细菌的活性，标本处理过程中是否容易产生气溶胶，使用每种技术产生感染性气溶胶的可能性，实验室的工作量，患者的流行病学特点，以及实验室工作人员的健康。相对风险总结如下：直接涂片进行抗酸染色镜检，和用Xpert MTB/RIF处理样本最低要求足够的通风*；与其它区域分离的实验室；进入实验室仅限于授权人员；涂片制备的工作台与实验室其他工作台分离。*如果当地气候条件允许的情况下，可以打开窗户确保足够的通风。排气扇可用于确保足够的室内换气。当气候条件不适于开窗，应考虑机械通风系统，提供一个不在房间里循环的向内流动的空气。痰标本进行初步培养接种，直接硝酸还原酶法（NRA），直接的显微观察药物敏感性法（MODS）或者直接线性探针检测（LPA） 最低要求与其他区域分离的实验室；进入实验室仅限于授权人员；地板，墙壁，天花板，长椅和家具有不透水表面；窗口应永久关闭。空气供给是被动的或没有再循环；用气溶胶紧桶离心；在适当的生物安全柜（BSC）处理标本，I类（EN12469/NSF49）或类

5、IIa2（NSF49）或II类（EN12469）配有HEPA过滤器H14；生物安全柜通过认证的制造商设计，正确安装，定期维护和至少每年现场重新认证； 控制通风系统保持定向气流进入实验室，从功能清洁区到污染区，至少每小时6到12次换气*。*控制通风系统的安装应与工程专家规划。 利用表型的方法和/或线性探针试验进行培养鉴定和药敏试验（DST）最低要求：满足上述试验的所有要求，此外：密闭实验室，双门入口；现场和实验室附近有高压灭菌器，用于废物安全处置。适用于不同实验室服务水平的技术 技术程序的专业性特点，实验室管理和实施，需要在不同水平的实验室检测中确保实验室质量，有明确的标本转诊机制。传统的结核诊断的分层实验室服务在许多资源文件中有所描述3。三个主要的实验室服务水平对大多数国家是共同的：周边水平（区级）：进行痰涂片镜检；利用Xpert MTB/RIF进行结核和利福平耐药检测；需要进一步检测时将标本或和病人转交于高一级水平实验室。中间水平（地区级）：进行痰涂片镜检；利用Xpert MTB/RIF进行结核和利福平耐药检测；常规培养方法，有或没有菌种鉴定，一线药物敏感性试验（DST）；需要进一步

6、检测时（如：二线药物敏感性试验）将培养标本转交于高一级水平实验室。中心水平（国家或参考实验室）：进行痰涂片镜检；利用Xpert MTB/RIF进行结核和利福平耐药检测；常规和快速培养，表型药物敏感性试验和分子检测；需要进一步检测时（如二线药物敏感性试验或分子测序）将菌株转交于其他国家或地区的超国家参考实验室。世界卫生组织推荐的技术显微镜检查分枝杆菌区别于其他微生物的特点是有厚的含脂质的细胞壁，尽管用含酸试剂脱色仍可保留生化染色（所谓的“抗酸性”）。优点：痰涂片镜检是简单和便宜的，可快速检测肺结核；肺结核，特别是有空洞疾病的患者的痰标本通常包含足够大量的抗酸杆菌，可通过显微镜容易的检测到。缺点：直接涂片镜检是相对不敏感的，镜检阳性需每毫升痰至少有5000个细菌。对合并HIV感染的肺外结核患者，和非结核分枝杆菌（NTM）感染患者中，涂片灵敏度进一步降低。局限性：抗酸杆菌（AFB）显微镜检查不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌（NTM），不能区分活菌死菌，也不能区分敏感与耐药菌株。传统的光学显微镜检查直接在痰标本进行萋-尼氏光学显微镜检查适用于所有实验室服务水平，包括在初级卫生保健中心或地区

7、医院的周围实验室。没有足够的证据显示预处理痰标本（如浓缩或化学处理）比直接涂片镜检提供更优异的结果。因此不推荐在项目设置中使用这些方法。萋-尼氏光学显微镜检查的数量每个检查者每天不应超过20张，因为过多会引起视觉疲劳导致的读片质量下降；另一方面，萋-尼氏光学显微镜检查读片熟练程度只能通过每周检查至少10-15个涂片来保持4。一般来说，每100,000人口设置一个萋-尼氏光学显微镜检查中心是足够的；然而，萋-尼氏光学显微镜检查服务的扩张也应该考虑到现有服务的定位和利用，城市/农村人口分布，和样品转运机制。传统的荧光显微镜检查传统的荧光显微镜通常使用石英卤素灯或高压汞灯为光源。较低的物镜放大率是用来扫描涂片，允许一个更大区域的涂片可见，因此比萋-尼氏光学显微镜检查用时更少。传统的荧光显微镜平均比萋-尼氏光学显微镜敏感10%，但需要熟练的技术知识。资金和运营成本也相对更高。因此世界卫生组织推荐在每天超过100个涂片的中间水平实验室采用传统的荧光显微镜检查方法5。发光二极管（LED）荧光显微镜LED技术的出现使荧光显微镜可以使用更便宜的光源。LED显微镜或附件需要较少的功率，能够在电池上运行，

8、灯泡有一个很长的半衰期，并且破损后不会释放潜在的有害物质。最近世界卫生组织的评估确定LED显微镜相比传统的荧光显微镜具有诊断准确性，并且比传统的萋-尼氏光学显微镜效率更高。因此建议LED显微镜可以替代常规荧光显微镜，并且在高和低容量的实验室LED显微镜可以阶段性的替代传统的萋-尼氏光学显微镜6。培养和菌种鉴定优点：结核分枝杆菌的培养和鉴定提供了确诊结核的依据，显著的增加了病例数的发现（通常30%至50%），并且可以更早的发现病例（通常在他们具有传染性以前）。培养也可以提供必要的菌株进行常规药敏试验。缺点：培养比显微镜检查更复杂和昂贵，需要培养基制备、标本处理，和微生物生长的设施，特定的实验室设备，熟练的技术人员，和适当的生物安全条件。局限性：标本在培养前需要净化来减少其它微生物的过量生长。所有的净化方法在一定程度上都对分枝杆菌有害，因此培养不是100%敏感。良好的实验室实践可保持分枝杆菌和其它污染的微生物之间的平衡。固体和液体培养方法适用于中心/国家参考实验室（或在大型国家区域实验室）。通常，一个培养实验室足以覆盖50万到100万的人口。固体培养方法比液体培养系统更便宜，但由于分枝杆菌

9、生长缓慢结果总是延迟。液体培养比固体培养基多报告10%病例，并且自动化系统可以提前数天报告（不是几周）。然而，液体系统更容易受到污染，并且大量的感染性材料的操作需要适当的授权和足够的安全措施。阳性的培养应可以区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌。非结核分枝杆菌在艾滋病病毒感染者中常见，并且患病率因国家而异。对非结核分枝杆菌的治疗方法与结核和耐药结核完全不同。作为最低要求，进行药物敏感试验的实验室必须能区分结核分枝杆菌与其他非结核分枝杆菌（进一步的分型在战略性计划中没有推荐）。通常结合培养生长的生物学特性和选定的分子或生化试验（不确定性会延迟最终结果报告）用来进行确认7。推荐的培养菌株的快速免疫层析试验（所谓的带形态试验）鉴定能在15分钟内提供一个明确的鉴定结核分枝杆菌的结果8。分子检测，生化法和带形态试验适合进行培养和药敏试验的实验室。 药物敏感性试验优点：药物敏感性试验提供了耐药结核分枝杆菌的明确诊断。有许多不同的药物敏感试验：表型的方法包括在抗结核药物的存在下检测结核分枝杆菌的生长（指示耐药性）或生长抑制（表示药物敏感性）。基因型的方法是针对特定的耐个别药物的分子突变。表型药物敏感性试验是在固体或液体培养基中进行的直接或间接的试验。直接测试，是一组含有药物和不含药物的培养基中直接接种浓缩后的样品。间接测试包括从原始标本中得到的纯培养物接种到含药物的培养基。间接表型试验已被广泛验证，是目前被视为金标准。常用的三种方法：比例法，绝对浓度法，和耐药倍数法。对一线抗结核药物，这三种药物敏感性试验结果没有明显差异。缺点：考虑到适当的实验室基础设施的需求（特别是生物安全）和现有的技术/方法的技术复杂性，药物敏感性试验仅适用于中央/国家参考实验室水平。局限性：药物敏感性试验的准确度因检测药物不同而

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