贝类包纳米虫病焦磷酸测序检测方法的建立与应用
15页1、贝类包纳米虫病焦磷酸测序检测方法的建立与应用 王彩霞 吴绍强 林祥梅 王素华 冯春燕 徐赓 中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所 浙江省温州出入境检验检疫局 山东省沂南县畜牧兽医局 摘 要: 以焦磷酸测序技术为检测平台, 在研究包纳米虫基因特性的基础上, 选择包纳米虫 (Bonamiaspp.) DNA 序列的保守区域, 利用焦磷酸测序软件设计专用引物。以 OIE 推荐的 PCR 方法构建的阳性质粒作为模板, 建立了包纳米虫的 PCR-焦磷酸测序检测方法, 确定测得序列为包纳米虫序列, 经酶切位点分析可鉴别感染种类。以建立的包纳米虫 PCR-焦磷酸测序方法对进口牡蛎 (Ostrea gigas thunberg) 样品进行检测, 同时以 OIE 推荐的 PCR-RFLP 方法进行对照检测, 检测结果表明, 本研究建立的 PCR-焦磷酸测序检测方法可以在基因序列水平上准确鉴定样品是否为包纳米虫感染以及感染种类, 检测结果与 OIE 推荐方法的检测结果一致。研究结果表明, 本研究建立的检测方法可应用于口岸包纳米虫感染情况的检测鉴定。关键词: 牡蛎; 包纳米虫; 聚合酶链式反应; 焦磷酸测序
2、; 检测; 鉴定; 作者简介:王彩霞 (1982-) , 女, 助理研究员。E-mail:作者简介:吴绍强 E-mail:收稿日期:2016-12-11基金:国家科技支撑计划项目 (2013BAD12B02) 资助Development and Application of Pyrosequencing Method Detecting Bonamia spp. Caused Disease of BivalvesWANG Cai-Xia WU Shao-Qiang LIN Xiang-Mei WANG Su-Hua FENG Chun-Yan XU Geng The Institute of Animal Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine; Wenzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau; Bureau of Animal Husbandry and Veterinary in Yinan County of Shandong Province; A
3、bstract: One pair of specific primers were designed and used to pyrosequencing the conserved region of Bonamia DNA with PyroMark software basing on pyrosequencing platform and Bonamiagene characteristics.PCR-pyrosequencing method was established with the recombinant plasmid of Bonamia spp.constructed with OIE PCR method as the template.The obtained sequence can be identified as the sequence of Bonamiaspp.through Blast analysis, and enzyme digestion site analysis identified the specie as Bonamias
4、pp.The imported oysters were detected with the newly developed method and PCR-RFLP as well as was recommended by OIE.The result showed that the developed PCR-pyrosequencing method can be used to correctly identifying Bonamiaspp.infection and species.The detection results were consistent with that yielded with OIE method.Therefore, this method can be applied to the detection and identification of Bonamiaspp.infection in port.Keyword: Oyster; Bonamia spp.; PCR; pyrosequencing; detection; identific
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