穿孔素适配体的筛选及电化学传感器的制备

1、穿孔素适配体的筛选及电化学传感器的制备 孟凡飞 刘畅 蒋栋能 张立群 蒲晓允 中国人民解放军陆军军医大学新桥医院检验科 摘 要： 目的 研发能特异性结合穿孔素的 DNA 适配体并构建适配体电化学传感器, 为发展穿孔素的新型检测技术提供基础。方法 体外合成全长为 81 个碱基并含有 35个随机寡核苷酸的单链 DNA 文库, 库容量大约为 11010, 以穿孔素蛋白为靶标, 利用指数富集配体系统进化技术 (SELEX) , 从单链 DNA 文库中筛选能够结合穿孔素蛋白的 DNA 适配体;采用 M-fold 程序 (version 3.2) 预测二级结构;设计并构建适配体电化学传感器, 进行穿孔素电化学特异性检测, 绘制标准曲线。结果 经多轮筛选, 获得 6 条穿孔素蛋白的 DNA 适配体, 分别为序列SEQ1SEQ6, 适配体 SEQ6 能够特异性结合穿孔素, 并可通过电化学方法用于检测穿孔素, 而其与牛血清清蛋白、-干扰素、肿瘤坏死因子 结合较弱。该电化学传感器检测穿孔素的线性水平范围为 120nmol, 检出限为 0.7nmol。结论 成功利用 SELEX 筛选获得特异结合穿孔素的 D

2、NA 适配体, 其在研发针对穿孔素的新型检测技术方面具有应用潜能。关键词： 穿孔素; 适配体; 指数富集配体系统进化技术; 作者简介：孟凡飞, 男, 技师, 主要从事适配体检测方面的研究。作者简介：蒲晓允, E-mail:。收稿日期：2017-05-04Screening of perforin aptamers and preparation of electrochemical aptasensorMENG Fanfei LIU Chang JIANG Dongneng ZHANG Liqun PU Xiaoyun Department of Clinical Laboratory, Xinqiao Hospital of PLA Army Medical University; Abstract： Objective To research and develop DNA aptamers specifically combining with perforin and to construct an aptamers electrochemical aptasensor to

3、provide a basis for developing perforin new-type detection technique.Methods The total length of 81 basic groups and single stranded DND library containing 35 random oligonucleotides were synthesized in vitro.The DNA library capacity was approximately 11010.The DNA aptamers capable binding with perforin were screened by using the systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) technique from single stranded DNA library with perforin protein as target.The secondary structures of

4、 aptamers were predicted by MFold program (version 3.2) .The electrochemical aptasensor was design and constructed for conducting the perforin electrochemical specificity detection and drawing the standard curve.Results Six perforin protein DNA aptamers were obtained by multiple screening, which were sequences SEQ1-SEQ6 respectively.The aptamer SEQ6 could specifically bind with perforin and could be used to detect perforin by electrochemical method, while its binding with BSA, TNF-and IFN-were a

5、ll weaker.The aptasensor exhibited a linear range of 1-20 nmol for detecting perforin with a detection limit of 0.7 nmol.Conclusion The DNA aptamers specifically combining with perforin is successfully obtained by using the SELEX technique, which may have application potentials in the aspects of researching and developing new type detection technique aiming at perforin.Keyword： perforin; aptamers; SELEX; Received： 2017-05-04穿孔素是机体内具有细胞毒作用的效应分子, 主要由细胞毒性 T 细胞和自然杀伤细胞 (NK 细胞) 细胞质颗粒释放1, 具有抗病毒、抗肿瘤等活性,

6、 在免疫监视中起重要作用。适配体是利用指数富集配体系统进化技术 (SELEX) 从含有大量序列的随机文库中筛选出能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体2。与抗体比较, 适配体具有易合成储存、易修饰、免疫原性低、价格低廉及低毒性等特点。目前, 适配体作为新型医疗工具被广泛应用于研究、诊断和治疗3。传统的穿孔素检测方法通常为酶联免疫吸附试验 (ELISA) , 此方法成本相对较高。利用 DNA 适配体替代抗体检测穿孔素将更为经济、高效。至今为止, 国内外尚无穿孔素适配体的相关报道, 本研究通过 SEL-EX 筛选获得针对穿孔素的适配体, 并通过电化学方法在体外分析其对穿孔素的结合性质。现报道如下。1 材料与方法1.1 材料单链 DNA (ssDNA) 文库 (南京全式金公司) , 由 81 个寡核苷酸构成, 两端为18 个碱基的固定序列, 中间为 35 个碱基的随机序列, 库容量约为 110, 包括5-CCC CTG CAG GTG ATT TTG CTC AAG T- (N35) -AGT ATC GCT AAT CAG GCG GAT-3、引物P81-SP (5-CCC CTG CAG

7、 GTG ATT TTG CTC AAG T-3) 、引物P81-AP (5-BiotinATC CGC CTG ATT AGC GAT ACT-3) 。其他材料包括 Dynal 公司提供的 Dynabeads M-280Streptavidin (DM-S) , Invitrogen 公司提供的酵母 tRNA, Takara 公司提供的聚合酶链反应 (PCR) 试剂, 欧孚生物科技有限公司提供的 PCR 纯化试剂盒, Amresco 公司提供的牛血清清蛋白 (BSA) , 艾博抗 (上海) 贸易有限公司提供的重组人穿孔素蛋白、干扰素-、肿瘤坏死因子-, sigma 公司提供的二甲基甲酰胺 (DMF) 、硫酸铵、氢氧化钠等。1.2 方法1.2.1 羧基磁珠包被蛋白取 1 mL DMF 溶解水平为 210/mL 的 DM-S 磁珠溶液于离心管 (EP 管) , 0.1mol/L 选择缓冲液 (50mmol/L 三羟甲基氨基甲烷、100mmol/L 氯化钠, 1mmol/L 氯化镁, 5mmol/L 氯化钾, pH 7.4) 洗涤磁珠, 600L 结合缓冲液 (10mmol/L 三羟甲基氨

8、基甲烷、1mmol/L 乙二胺四乙酸、2.0mmol/L 氯化钠, pH 7.4) 重悬, 加入 600L 水平为 1mg/mL 穿孔素溶液, 混匀;加入 600L 水平为3 mol/L 的硫酸铵溶液, 混匀, 37震摇孵育 20h, 放磁力架 5min, 吸出上清液, 收集到全部磁珠, 封闭缓冲液1%BSA-磷酸缓冲盐溶液 (PBS) , pH 7.4洗包被磁珠 4 次, 1.8mL 封闭缓冲液重悬磁珠 4保存备用。1.2.2 ssDNA 文库筛选取 2 000pmol ssDNA 文库, 用 1mL 选择缓冲液稀释, 经 95变性 5min, 冰浴15min。先将 ssDNA 文库加入 BSA (25mg/L) 封闭的 EP 管中进行负筛, 37孵育 1h, 去除与管壁结合的 ssDNA, 将负筛后的 ssDNA 文库与包被穿孔素的磁珠混合, 同时加入酵母 tRNA 竞争结合, 37反应 1h, 置磁力架, 弃上清液, 用洗涤选择缓冲液 (0.2%BSA, 选择缓冲液) 洗去未结合的 ssDNA, 200L 去离子水重悬穿孔素包被磁珠, 100加热 5min, 置磁力架, 分离上清

9、液保存。1.2.3 PCR 扩增以筛选得到的上清液为模板, 优化 PCR 反应条件, 引物 P81-SP 和 P81-AP 扩增双链 DNA (94预变性 5min, 94变性 30s, 50退火 30s, 72延伸 30s, 72延伸 5min, 30 个循环) 。1.2.4 PCR 产物纯化及分离 ssDNA严格按产品操作说明, 利用核酸纯化柱进行 PCR 产物纯化, 并在碱性条件下分离得到单链 ssDNA, 作为下一轮筛选的文库, 重复以上步骤。1.2.5 克隆测序及适配体二级结构分析将第 12 轮筛选产物克隆至 pMD18-T 载体中并转化至 DH5 感受态菌, 经蓝白斑筛选, 随机挑取 6 个克隆进行测序, 序列测定由上海生工生物技术公司进行。按着 Zuker 的最小自由能原则, 通过 M-fold 程序 (version 3.2) 对适配体进行二级结构的分析预测4。1.2.6 适配体 SEQ6 电化学传感器的构建(1) 适配体 SEQ6 电化学应用检测原理。设计并合成 1 条 5端巯基化、中间序列为 G4 分体而两端序列与穿孔素适配体 SEQ6 互补的探针 (设计探针) , 另合成 1 条 5端加入核酸外切酶作用位点 (AAA) 的 SEQ6, 设计探针与 SEQ6 预先形成 DNA 双连体, DNA 双连体通过金巯键固定在已经预处理好的金电极上, 巯基己醇封闭。穿孔素加入后, SEQ6 和其特异性结合, 形成具有特定空间构象的聚合物, 使 SEQ6 从 DNA 双连体解离出来, 从而使 DNA 双链体的结构破坏, 将设计探针中 G4 分体结构暴露出来。为监测每一步实验成功与否, 笔者将每一步固定结合后的电极进行电化学循环伏安法测试, 循环伏安法采用的反应体系为含有 0.1mol/L 氯化钾和 5mmol/L 六氰合铁络合离子/六氰合亚铁络合离子的混合溶液。扫描电压为 (-0.2) 0.6V, 扫描速率为 50mV/s。存在氯化高铁血红素 (Hemin) 的情况下, G4 分体发生结构变化, 与 Hemin 特异度结合形成血红素过氧化物酶的模拟酶体, 后者可催化过氧化氢的氧化还原反应,

《穿孔素适配体的筛选及电化学传感器的制备》由会员小**分享，可在线阅读，更多相关《穿孔素适配体的筛选及电化学传感器的制备》请在金锄头文库上搜索。