柯萨奇病毒的RTPCR实验
26页1、柯萨奇病毒的RT-PCR实验室诊断,属于小病毒科肠道病毒属,最易在灵长类动物细胞中生长。 病毒分为、两组。柯萨奇病毒组有个血清型,柯萨奇病毒组有个血清型。,柯萨奇病毒,单股正链RNA,全长大约7.4Kb,病毒直径为2530nm,球形,无包膜,病毒衣壳由VP1-VP4等构成,呈20面体立体对称。,柯萨奇病毒(Coxsackie virus,CV ) 的诊断方法: 病毒分离、动物接种 操作烦琐, 成功率低, 影响诊断的敏感性; ELISA 法 检测患者血清中相应的特异性IgM 、 IgG抗体, 但不能获得有关病毒更多的信息; RT - PCR 法 既可以通过检测病人样本中的病毒RNA 来明确诊断, 也可以通过进一步的测序来分析病毒流行株特定序列, 为基因分型提供依据。,两端为保守的非编码区,中间为编码区。5端共价结合一小分子蛋白质Vpg(约7kDa),与病毒RNA合成和基因组装配有关;3端带有polyA尾。编码区编码的病毒结构蛋白VP1VP4,VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣壳的表面,有中和抗原位点;VP4位于衣壳内部,一旦病毒VP1与受体结合后,VP4即被释出,衣壳松动,病毒基因组脱
2、壳穿入。,逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”,由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。,Types of RT-PCR Reactions,Standard RT-PCR usually with one-step (recommended) Sensitive and specific Nested PCR More sensitive than standard Contamination is a major problem Only for very experienced labs Real Time RT-PCR Sensitive and specific Reagent and equipment costs are a factor High throughput,RT-PCR实验程序:标本的采集、
3、标本RNA的提取、引物、RT-PCR反应体系、温度循环参数、琼脂糖电泳、凝胶成像、结果判定及序列测定,一步法:反转录PCR在一个管子里完成,得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增,灵敏度更高。 两步法:反转录和PCR分开,灵活而且严谨,但灵敏度不如前者高。,RNA操作注意事项,全程戴手套 灭菌、清洁的塑料管或无RNA酶的玻璃制品 高压带滤芯枪尖 RNA提取试剂要保证无RNA酶 所有试剂开盖时要标明日期 在RNA提取、RT-PCR和测序过程中使用无RNA 酶水 操作快捷,提取后的RNA应放在-70度 备有冰盒,全程中保持RNA在低温状态下 避免反复冻融RNA,防止RNA降解。,PCR反应系统的组成: 耐热DNA聚合酶(Taq酶):这是由耐热水生细菌体内提取的一种DNA聚合酶。 模板DNA:即待分析的目的DNA,其长度不宜大于10kb。 两种引物:为了保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸,需要两种引物,分别位于两条互补模板DNA链的3-端。 四种脱氧核糖核苷酸:用作底物的dNTPS。 缓冲溶液:保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值,PCR技术类似于DNA的天然复制过程,其
4、特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成: 模板DNA的变性:模板DNA经加热至93左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备; 模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; 引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟,23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。,PCR 注意事项,PCR关键环节 模板; 引物; 酶 dNTP; 循环条件; 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。,模 板,1、杂质蛋白质;特别是染色体中的组蛋白; 2、Taq酶抑制剂; 3、在提取制备模板时丢失
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