精编制作细胞分离与培养技术PPT课件
127页1、1 临床药理研究所 细胞分离与培养技术 2 现代生物技术 基因工程技术 细胞工程技术 酶工程技术 发酵工程技术 细胞培养 3 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞从原代组织中分离细胞从原培养容器中分离细胞 传代培养 原代培养 4 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 采血方法 人静脉穿刺 耳垂或手指针刺采血 小动物 大鼠 小鼠 剪尾法 眼眶采血 心脏穿刺法 断颈取血或股动脉放血 兔耳静脉或动脉穿刺取血 5 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 血液抗凝方法 肝素法 按每ml血液约用0 1 0 2mg肝素 即5 肝素溶液2 4 l 草酸盐法 取草酸钾0 2g 草酸铵0 3g 加双蒸水10ml溶解后 取0 2ml放入5ml的试管中 使其干燥 若采用5ml以下的血液可直接注入此试管中 轻轻摇晃 枸橼酸钠法 先配制2 枸橼酸钠 取0 15 0 2ml加于1ml血液中即可抗凝 EDTA法 186 1 每ml血液中加0 5mmol LEDTA2 l 6 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 体液标本采集 在局部70 酒精消毒灭菌后 用灭菌注射器穿刺入体腔 如胸腔 腹腔 关节腔等 抽取液体样品 膝关
2、节腔穿刺 胸腔穿刺 7 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 血样中红细胞和白细胞的分离 利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理 以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离 抗凝血 室温或37 下直立静置30 60min 红细胞沉降至下层 中间乳白色薄膜层为白细胞及血小板 上层为淡黄色血浆 也可将抗凝血与3 明胶 经灭菌消毒 等量或3 l量混合于离心管中 直立静置30 60min 红细胞沉于管底 上层乳白色混浊液含白细胞 8 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 血中单个核细胞的分离 单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞 其相对密度在1 050 1 077之间 采用速度沉降法原理使其分离 淋巴细胞分离液 9 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 血中单核细胞的分离 利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离 单个核细胞悬液 多将悬液放入12cm直径的培养皿中 于37 培养箱中静置30 60min 此时单核细胞贴壁 而淋巴细胞尚未贴壁 倾出未贴壁细胞 并用Hanks液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下未贴壁细胞 淋巴细胞 用Hanks液强力冲洗吹打与震荡 将贴壁的单核细胞冲
3、落或用刮刀轻刮 收集贴壁的单核细胞 计数后分别制备所需浓度的细胞悬液 10 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 黏附法分离血中单核细胞 T B淋巴细胞 因B淋巴细胞和单核细胞能黏附于尼龙纤维柱上 聚酰胺纤维柱 所以可将其与T淋巴细胞分离 11 具体步骤 单个核细胞用含20 小牛血清RPMI 1640制成 2 5 3 107 ml的细胞悬液 先用Hanks液 再用含20 小牛血清的RPMI 1640液冲洗平衡尼龙纤维柱 冲洗液尽量流净 将尼龙柱预温37 再用配制的单个核细胞悬液2ml装入尼龙纤维柱 不使流出 37 温箱内静置l小时 取下注射针头 用预温37 含20 小牛血清的RPMI 1640培养液冲洗尼龙纤维柱 洗出者即为未黏附的T淋巴细胞 从注射器内取出尼龙纤维 在4 的RPMI 1640液内漂洗 并轻轻挤压 将黏附的B细胞洗脱收集 B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴壁法将其分离 收集的T B淋巴细胞可分别用Hanks液悬浮 洗涤 离心 250g 7min 并重复洗涤3次 计算活细胞 计数悬液中的细胞数后制备所需浓度的T和B淋巴细胞悬液 12 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 免
4、疫磁珠法 MACS 分离T B淋巴细胞 磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子 如Fe3O4 为原料聚合而成的一种以金属离子为核心 外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒 即磁性微珠 在液相中 受外加磁场的吸引作用 磁性微珠可快速沉降 以磁性微珠为载体 包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠 13 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是 首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上 待它与混合体系中的细胞反应后 利用磁力的作用 使与致敏结合的细胞与其它物质分离 达到纯化 分离的目的 通常有二种分离方式 阳性分离和阴性分离 阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞 阴性分离是利用磁珠去除无关细胞 使靶细胞得以分离 14 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离 如T CD3 B CD19 淋巴细胞 内皮细胞 CD34 造血祖细胞 CD34 单核 巨噬细胞 CD14 胰岛细胞 胰岛GK和GLUT2 葡萄糖转运子 多种肿瘤细胞等 15 细胞分离技术 从血液 体液中分离细
5、胞 16 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 17 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 18 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 MACS技术优点 稳定 高质量的分选 纯度 90 99 对细胞无损伤操作简便 快速 消毒方便 手动分选30分钟内完成 autoMACS分选2 5 10分钟之内完成 从实验室到临床 MACS技术可以实现105 1011个细胞分选 有autoMACS和CliniMACS 分选后细胞适用于后续实验 分选后适用于细胞培养和体内实验 分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用 从细胞到分子分选 不仅可以分选各种细胞 还可以分选转染细胞 亚细胞物质 蛋白质 DNA RNA及mRNA MACS技术缺点 分离效率较流式细胞仪分选略低且耗材相对较贵 适合无大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选 只适用于简单标记的细胞分离 19 细胞分离技术 从血液 体液中分离细胞 流式细胞术分离法分离T B淋巴细胞 密度梯度离心法分离单个核细胞 用RPMI 1640培养基配成1 107 ml 加适量FITC 抗CD3或FITC 抗CD19 4 孵育30min 用RPMI 16
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