精编制作TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成PPT课件
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TUNEL TdT mediated dUTP nick end labeling 法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究 方法 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行 原位染色 能准确的反应细胞凋亡最典型的生物 化学和形态特征 可用于石蜡包埋组织切片 冰 冻组织切片 培养的细胞和从组织中分离的细胞 的细胞凋亡测定 并可检测出极少量的凋亡细胞 灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法 要高 因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用 TdT介导的dUTP缺口末端标记技术 TUNEL TUNEL TUNEL的原理 TUNEL的操作步骤 结果及注意事项 主要试剂 1 缓冲液 Labeling Buffer 用于维持一定的反应条件 含有以下成分 500mmol L二甲胂酸钾 pH7 2 10mmol L CoCl2 氯化钴 1mmol L DTT 二硫苏糖醇 2 末端脱氧核糖核酸转移酶 TdT 催化3 OH末端 dUTP反应的关键酶 3 荧光素 dUTP TdT的底物和本实验的标记物 4 蛋白酶K 消化组织 增加细胞通透性 TUNEL的原理 凋亡细胞的特征是 内源性核酸内切酶被激活 细胞 自身的染色质DNA被切割 出现单链或双链缺口 并产生与DNA断点数目相同的 3 OH末端 末端 脱氧核糖核酸转移酶 Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT 能将脱氧核糖核苷酸连接到DNA 的3 末端 TUNEL的原理是 用荧光素 fluorescein 标记的脱 氧核糖核苷酸 在TdT 的作用下连接到凋亡细胞中 断裂DNA的3 OH末端 用荧光显微镜即可观察结 果 在此基础上连接辣根过氧化酶标记的荧光素抗 体 可进一步放大检测信号 并且普通显微镜观察 实验结果 由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA的断裂 因而没有3 OH形成 很少能够被染 色 TUNEL原理 标本处理 实验步骤 实验流程 结果 注意事项 极少数细胞凋亡时没有DNA断裂或DNA裂解不完 全 此时不适用TUNEL法检测 进而产生假阴性 结果 在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳 性 在高度增殖 代谢的组织细胞中可产生大量 DNA片断 从而引起假阳性结果 在需要严格判断细胞凋亡 的情况下 最好同时检测多个凋亡指标
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