人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立
12页1、1人 MCHR2 真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立作者:杨俊霞 石华 魏丽丽 袁成福 陈济 易发平 马永平 宋方洲 【关键词】 MCHR2;真核表达载体;转染;基因表达 【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression vector of human melaninconcentrating hormone receptor 2 (MCHR2) and stably transfect HEK293 cells with it. METHODS: The fulllength MCHR2 cDNA fragment was amplified by PCR from the human fetal brain cDNA library and was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). After identification of restriction digestion and PCR, the recombinant plasmid w
2、as transfected into HEK293 cells by lipofectamine. After screening culture by G418, a stablytransfected cell line was established, and the transcription and expression of the MCHR2 gene were identified by RTPCR, Western blot and immunofluorescence assay. RESULTS: The eukaryotic expression vector pcDNA3.1MCHR2 was successfully constructed and the MCHR2 gene was transfected stably into HEK293 cells. A stablytransfected cell line was established and the MCHR2 2gene was expressed successfully. CONCL
3、USION: The establishment of the stablytransfected cell line and the expression of the target gene provide a solid experimental foundation for further studies on the function of the MCHR2 gene. 【Keywords】 MCHR2;eukaryotic expression vector; transfection;gene expression 【摘要】 目的:构建人 MCHR2 真核表达载体,转染HEK293 细胞,建立稳定转染细胞系 . 方法:采用 PCR 方法,以人胎脑 cDNA 文库为模板扩增人 MCHR2 基因的全长 cDNA 编码区序列,DNA 重组技术将其定向插入到真核表达载体 pcDNA3.1(+),经酶切和 PCR 鉴定后,脂质体转染法转染 HEK293 细胞,通过G418 选择培养,建立稳定转染细胞系,RTPCR,Western Blot 及免疫荧光法检测 MCHR2 的表达.
4、结果:成功构建了pcDNA3.1MCHR2 真核表达载体并已稳定转入 HEK293 细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因. 结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究 MCHR2 的功能提供了良好的实验基础. 【关键词】 MCHR2;真核表达载体;转染;基因表达 0 引言 近年来研究发现肥胖的发生与下丘脑对摄食的神经内分泌调控密切相关1 ,继神经肽 Y、刺鼠相关蛋白、增食欲素之后,又3一个增强食欲的神经肽黑色素浓集激素(melaninconcentrating hormone, MCH)进入人们的视野 . 现已发现其有 2 种受体亚型,即MCHR1 和 MCHR2 均属于 G 蛋白偶联受体家族 . 通过构建转基因和基因敲除动物模型已对 MCH 及 MCHR1 与肥胖及能量代谢的关系进行了深入细致的研究,但有关 MCHR2 的功能至今仍不十分清楚. 为此我们构建了人 MCHR2 基因的真核表达载体,并转染HEK293 细胞,建立了稳定表达 MCHR2 的细胞系,为深入研究MCHR2 的生物学功能奠定实验基础. 1 材料和方法 1.1 材料人胎脑 cDNA 文库购自 Clo
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