人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

1人 MCHR2 真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立作者：杨俊霞 石华 魏丽丽 袁成福 陈济 易发平 马永平 宋方洲 【关键词】 MCHR2；真核表达载体；转染；基因表达 【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression vector of human melaninconcentrating hormone receptor 2 (MCHR2) and stably transfect HEK293 cells with it. METHODS: The fulllength MCHR2 cDNA fragment was amplified by PCR from the human fetal brain cDNA library and was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). After identification of restriction digestion and PCR, the recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells by lipofectamine. After screening culture by G418, a stablytransfected cell line was established, and the transcription and expression of the MCHR2 gene were identified by RTPCR, Western blot and immunofluorescence assay. RESULTS: The eukaryotic expression vector pcDNA3.1MCHR2 was successfully constructed and the MCHR2 gene was transfected stably into HEK293 cells. A stablytransfected cell line was established and the MCHR2 2gene was expressed successfully. CONCLUSION: The establishment of the stablytransfected cell line and the expression of the target gene provide a solid experimental foundation for further studies on the function of the MCHR2 gene. 【Keywords】 MCHR2；eukaryotic expression vector； transfection；gene expression 【摘要】 目的：构建人 MCHR2 真核表达载体，转染HEK293 细胞，建立稳定转染细胞系 . 方法：采用 PCR 方法，以人胎脑 cDNA 文库为模板扩增人 MCHR2 基因的全长 cDNA 编码区序列，DNA 重组技术将其定向插入到真核表达载体 pcDNA3.1(+)，经酶切和 PCR 鉴定后，脂质体转染法转染 HEK293 细胞，通过G418 选择培养，建立稳定转染细胞系，RTPCR，Western Blot 及免疫荧光法检测 MCHR2 的表达. 结果：成功构建了pcDNA3.1MCHR2 真核表达载体并已稳定转入 HEK293 细胞，建立了稳定转染细胞系，成功地表达目的基因. 结论：稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究 MCHR2 的功能提供了良好的实验基础. 【关键词】 MCHR2；真核表达载体；转染；基因表达 0 引言 近年来研究发现肥胖的发生与下丘脑对摄食的神经内分泌调控密切相关1 ，继神经肽 Y、刺鼠相关蛋白、增食欲素之后，又3一个增强食欲的神经肽黑色素浓集激素(melaninconcentrating hormone, MCH)进入人们的视野 . 现已发现其有 2 种受体亚型，即MCHR1 和 MCHR2 均属于 G 蛋白偶联受体家族 . 通过构建转基因和基因敲除动物模型已对 MCH 及 MCHR1 与肥胖及能量代谢的关系进行了深入细致的研究，但有关 MCHR2 的功能至今仍不十分清楚. 为此我们构建了人 MCHR2 基因的真核表达载体，并转染HEK293 细胞，建立了稳定表达 MCHR2 的细胞系，为深入研究MCHR2 的生物学功能奠定实验基础. 1 材料和方法 1.1 材料人胎脑 cDNA 文库购自 Clontech 公司. 菌株 E. coli DH5，质粒 pcDNA3.1(+)和 HEK293 细胞由本教研室保存. RTPCR 试剂盒(TOYOBO 公司)；Taq DNA 聚合酶，T4 DNA 连接酶，限制性内切酶(EcoR I，Xho I)等工具酶(TaKaRa 公司) ；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒(Qiagen 公司)；脂质体LipofectamineTM2000 (Invitrogen 公司)；G418 (Amresco 公司)；总 RNA 抽提液 TriPure (Roche 公司)；MCHR2 抗体(Santa Cruz公司);HRP 标记的兔抗羊 IgG 和 FITC 标记的兔抗羊 IgG(北京鼎国生物技术有限公司). 1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成根据 GenBank 登录的人 MCHR2 基因的序列（序列号为：AY562946）设计引物. 上游引物为：5ccggaattcACCATGAATCCATTTCATGCATCTTG3；下游引物为：45ccgctcgagATGGTGATCCATGTACTTTCCTAA3. 其中分别在上游和下游引物的 5端加上了 EcoR I 和 Xho I 的酶切位点和 3 个保护碱基，并且在起始密码前添加了 Kozak 序列，引物由 TaKaRa 公司合成. 1.2.2 人 MCHR2 全长 cDNA 的获取以人胎脑 cDNA 文库为模板，采用 PCR 的方式扩增人 MCHR2 cDNA 的编码区，全长为1023 bp. PCR 50 L 反应体系中加入 cDNA 模板 2 L，10×PCR Buffer 5 L，MgCl2 3 L，2.5 mmol/L dNTP Mix 4 L，20 mol/L上下游引物各 1 L,，Taq 酶 0.5 L ，加水至 50 L. 反应条件：94 5 min；94 60 s，57 50 s，72 70 s，35 个循环；72 7 min. PCR 产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定. 1.2.3 人 MCHR2 真核表达载体的构建将上述 PCR 产物和pcDNA3.1(+)质粒分别用限制性内切酶 EcoR I 和 Xho I 酶切后，10 g/L 琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经 T4 DNA 连接酶连接后转化 E. coli DH5感受态，氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆进行酶切和 PCR 鉴定，阳性克隆的质粒 DNA 经测序分析后证实并命名为 pcDNA3.1MCHR2. 1.2.4 建立稳定转染人 MCHR2 的 HEK293 细胞系 HEK293细胞在含 100 mL/L 小牛血清的 DMEM/F12 培养基中，于 37 ，50 mL/L CO2 的饱和湿度下培养. 待细胞融合至 70%80时按照LipofeetamineTM 2000 操作说明书进行空质粒 pcDNA3.1(+)和重组质粒 pcDNA3.1MCHR2 的转染. 转染 48 h 后，用胰蛋白酶消5化细胞，在含有 G418 (700 mg/L)的选择性培养基中加压筛选约46 wk，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，有限稀释法扩增培养即为稳定表达人 MCHR2 的 HEK293 细胞系，命名为HEK293MCHR2 细胞. 1.2.5RTPCR 检测 MCHR2 转录水平的表达收集 HEK293 空质粒转染细胞以及 HEK293MCHR2 转染细胞，按 TriPure 试剂说明书抽提细胞总 RNA. 反转录 20 L体系中加入总 RNA 2 L，随机引物 1 L，5×RT Buffer 4 L，10 mmol/L dNTP 2 L，RNAase 抑制剂 1 L，MMLV 逆转录酶 1 L，加水补足至 20 L，混匀，30 10 min，42 20 min，99 5 min 终止反应. 以 GAPDH（450 bp）为内参进行 PCR 反应 . 在 25 L反应体系中加入 cDNA 模板 5 L，10×PCR Buffer 2.5 L，MgCl2 1.5 L，2.5 mmol/L dNTP 1 L，20 mol/L上下游引物各 0.5 L，Taq 酶 0.25 L，加水补足至 25 L，反应条件为：94 5 min；94 60 s，57 50 s，72 60 s，30 个循环；72 10 min. 取等体积 RTPCR 产物进行 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳分析. 1.2.6Western Blot 检测 MCHR2 翻译水平的表达收集转染细胞，裂解后取 20 g处理后的蛋白样品进行 SDSPAGE 电泳 (50 g/L 浓缩胶，恒压 80 V，30 min；100 g/L 分离胶，恒压 100 V，2.5 h)，电转移至 PVDF 膜上(恒流 80 mA，3 h)，50 g/L 脱脂奶粉室温振荡封闭 1 h，与 1200稀释后的一抗 4孵育过夜，PBST 洗膜 3 次，然后与 15000稀释后的 HRP 标记的二抗室温孵6育 2 h，PBST 洗膜 3 次，DAB 显色检测目的蛋白. 1.2.7 免疫荧光检测 MCHR2 蛋白在细胞中的定位细胞爬片48 h 后用 PBS 洗 3 次，40 g/L 多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 3次，500 mL/L 兔血清封闭 30 min，倾去兔血清，加入按 1100稀释的一抗，4孵育过夜， PBS 洗 3 次，加入按 1200稀释的FITC 标记的二抗，室温孵育 2 h，PBS 洗 3 次，500 mL/L 甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照. 2 结果 2.1 人 MCHR2 全长 cDNA 的获取以人胎脑 cDNA 文库为模板，利用 MCHR2 特异性的引物进行 PCR 扩增，产物用 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定. 所获 PCR 片段约为 1023 bp，与预期的人MCHR2 cDNA 全编码区的长度相符(图 1). 1：DNA Marker(DL 2000)；2 ：MCHR2 PCR 片段. 图 1 人 MCHR2 全长 cDNA 的 PCR 扩增（略） 2.2 真核表达载体 pcDNA3.1MCHR2 的鉴定双酶切鉴定显示(图 2)，重组质粒 pcDNA3.1MCHR2 经 EcoR I 和 Xho I 酶切后得到两条条带，一条约为 1.0 kb 大小的目的条带，一条为 5.4 kb大小的空载体条带，而 pcDNA3.1(+)空质粒只有一条 5.4 kb 的条带；PCR 鉴定结果为(图 3)，重组质粒 pcDNA3.1/MCHR2 经 PCR扩增得到一清晰的 1023 bp 的目的条带，长度与 MCHR2 cDNA 长度相符，而 pcDNA3.1(+)空质粒 PCR 结果无条带出现；以pcDNA3.1(+)质粒载体多克隆位点上的通用引物进行测序，证实7pcDNA3.1/MCHR2 重组质粒插入片段的序列与 MCHR2 的 cDNA序列完全一