第39章 基因工程及蛋白质工程
41页1、第三十九章 基因工程及蛋白质工程第一节 DNA 克隆的基本原理基因克隆的技术路线大致包括以下几个程序:分离制备待克隆的DNA 片段(目的DNA);在体外连接目的DNA 片段和载体;重组DNA 分子转入宿主细胞;筛选、鉴定阳性重组子;重组子的扩增。一DNA 限制酶与连接酶类型限制酶为多亚基双功能酶,S 亚基为识别亚基,识别位点为两部分序列,中间有一定长度的任意碱基对,M 亚基有甲基化酶活性,R 亚基为切割亚基,可在识别位点1kb 以上处随机切割。类型限制酶有两个相同的亚基组成,识别位点为46bp 的回文序列,切割位点在识别位点内,或靠近识别位点,经切割可以生成平头末端或粘性末端,可以产生相同粘性末端的不同的限制酶称作同尾酶。类型限制酶是分子生物学中最重要的工具酶。类型限制酶为两个亚基的双功能酶,M 亚基为识别亚基,R 亚基为切割亚基,切割位点在识别位点下游2426bp 处,特异性不强。EcoRI 与DNA 的复合体:外源DNA 可以被插入质粒载体:限制性内切酶切割DNA 形成对应的粘性末端:使用相同的粘性末端进行重组,会有较多的载体自身环化,或目的基因串联,目的基因的定向连接常使用两种限
2、制酶,产生两种不同的粘性末端。可以在载体和目的基因的两端连接接头(引入限制酶切点),或衔接物(含有粘性末端),再连接载体和目的基因。接头用于建立克隆片断的末端:大肠杆菌的连接酶只能连接粘性末端,T4 连接酶可以连接平头末端,其条件是:提高T4 连接酶的浓度;提高DNA 片段的浓度;降低ATP 浓度;加入多胺类如亚精胺;加入浓缩剂如乙二醇。T4 连接酶催化的反应:二分子克隆的载体与宿主系统1分子克隆的载体的基本条件能自主复制;具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点,并在位点中插入外源基因后,不影响其复制功能;具有1-2 个筛选标记;克隆载体必须是安全的,不应含有对受体细胞有害的基因,并且不会任意转入其他生物细胞;易于操作,转化效率高。现用的载体都是通过改造构建而成的。宿主细胞的基本条件是:易于接受外源DNA;自身无限制酶和重组能力;易于生长和筛选;符合安全标准。pBR322 是由几个质粒DNA 通过DNA 重组技术构建而成的克隆载体,分子的长度为4363bp。具有氨苄青霉素和四环素两种抗药性标记。pBR322 共有24 种限制性内切酶的单一识别位点,其中7 种酶(ecoRV,NheI,
3、BamHI,sphI,salI,Xma,Nru I)的识别位点位于四环素抗性基因内部,2 种酶(ClaI,Hind)的识别位点存在于这个基因的启动子内部。所以在这9 个限制性位点上插入外源DNA 通常都会导致抗四环素基因(tetr)的失活。3 种酶(scaI,PvuI,PstI)在氨苄青霉素抗性基因(ampr)内具单一的识别位点,在这3 个位点插入外源DNA 则会导致ampr 基因的失活。若将外源基因插入tetr 基因,将构成的重组质粒转入对四环素和氨苄青霉素均敏感的受体菌,则在含氨苄青霉素的平面培养基上生长,而在含四环素的平面培养基上不生长的菌落均含有外源基因。20 世纪70 年代早期主要利用天然质粒,1977 年Bolivar 等构建成功pBR322、1982 年Viera 和Messsing构建成功pUC 系列质粒,随后有不少穿梭质粒,表达质粒等问世。2pUC 载体系列是由大肠杆菌pBR322 质粒与M13 噬菌体改建而成的双链DNA 质粒载体,含有来自pBR322 质粒的复制起点(ori),氨苄青霉素抗性基因(ampr)以及大肠杆菌 半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码肽
4、链的基因,在lacZ 基因中有一个多克隆位点(MCS)区段。当外源的DNA 片段插入到这些克隆位点使 互补链破坏时,形成的是无活性的-半乳糖苷酶,被转化的大肠杆菌细胞,在Xgal-IPTG 培养基上形成白色菌落,而没有外源DNA 插入的质粒转化大肠杆菌细胞后,在Xgal-IPTG 培养基上形成蓝色菌落。pUC 质粒载体比pBR322 具有更小的相对分子质量,而且由于rop 基因的缺失(其基因产物ROP 蛋白,控制质粒复制),使得其拷贝数大增,每个细胞可达500-700 个拷贝,因此由pUC 质粒重组体转化的大肠杆菌细胞,可获得高产量的克隆DNA 分子。pUC18 和pUC19 的唯一差别是多克隆位点的方 向相反。Xgal(5 溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)可被-半乳糖苷酶水解生成深兰色的5-溴-4-靛兰,IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)可诱导-半乳糖苷酶-链的合成。适合于蓝白选择。3 噬菌体 噬菌体的基因组是长度约为50kb 的线性双莲DNA 分子。在其两端,各有一条由12 个核苷酸组成的互补粘性末端。当 噬菌体DNA 进入寄主细胞后,线性DNA 分子通过粘性末端的碱基配对而
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