第39章 基因工程及蛋白质工程

第三十九章 基因工程及蛋白质工程第一节 DNA 克隆的基本原理基因克隆的技术路线大致包括以下几个程序：分离制备待克隆的DNA 片段（目的DNA）；在体外连接目的DNA 片段和载体；重组DNA 分子转入宿主细胞；筛选、鉴定阳性重组子；重组子的扩增。一DNA 限制酶与连接酶类型限制酶为多亚基双功能酶，S 亚基为识别亚基，识别位点为两部分序列，中间有一定长度的任意碱基对，M 亚基有甲基化酶活性，R 亚基为切割亚基，可在识别位点1kb 以上处随机切割。类型限制酶有两个相同的亚基组成，识别位点为46bp 的回文序列，切割位点在识别位点内，或靠近识别位点，经切割可以生成平头末端或粘性末端，可以产生相同粘性末端的不同的限制酶称作同尾酶。类型限制酶是分子生物学中最重要的工具酶。类型限制酶为两个亚基的双功能酶，M 亚基为识别亚基，R 亚基为切割亚基，切割位点在识别位点下游2426bp 处，特异性不强。EcoRI 与DNA 的复合体：外源DNA 可以被插入质粒载体：限制性内切酶切割DNA 形成对应的粘性末端：使用相同的粘性末端进行重组，会有较多的载体自身环化，或目的基因串联，目的基因的定向连接常使用两种限制酶，产生两种不同的粘性末端。可以在载体和目的基因的两端连接接头（引入限制酶切点），或衔接物（含有粘性末端），再连接载体和目的基因。接头用于建立克隆片断的末端：大肠杆菌的连接酶只能连接粘性末端，T4 连接酶可以连接平头末端，其条件是：提高T4 连接酶的浓度；提高DNA 片段的浓度；降低ATP 浓度；加入多胺类如亚精胺；加入浓缩剂如乙二醇。T4 连接酶催化的反应：二分子克隆的载体与宿主系统1分子克隆的载体的基本条件能自主复制；具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能；具有1-2 个筛选标记；克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入其他生物细胞；易于操作，转化效率高。现用的载体都是通过改造构建而成的。宿主细胞的基本条件是：易于接受外源DNA；自身无限制酶和重组能力；易于生长和筛选；符合安全标准。pBR322 是由几个质粒DNA 通过DNA 重组技术构建而成的克隆载体，分子的长度为4363bp。具有氨苄青霉素和四环素两种抗药性标记。pBR322 共有24 种限制性内切酶的单一识别位点，其中7 种酶(ecoRV,NheI,BamHI,sphI,salI,Xma,Nru I)的识别位点位于四环素抗性基因内部，2 种酶(ClaI,Hind)的识别位点存在于这个基因的启动子内部。所以在这9 个限制性位点上插入外源DNA 通常都会导致抗四环素基因(tetr)的失活。3 种酶(scaI,PvuI,PstI)在氨苄青霉素抗性基因(ampr)内具单一的识别位点，在这3 个位点插入外源DNA 则会导致ampr 基因的失活。若将外源基因插入tetr 基因，将构成的重组质粒转入对四环素和氨苄青霉素均敏感的受体菌，则在含氨苄青霉素的平面培养基上生长，而在含四环素的平面培养基上不生长的菌落均含有外源基因。20 世纪70 年代早期主要利用天然质粒，1977 年Bolivar 等构建成功pBR322、1982 年Viera 和Messsing构建成功pUC 系列质粒，随后有不少穿梭质粒，表达质粒等问世。2pUC 载体系列是由大肠杆菌pBR322 质粒与M13 噬菌体改建而成的双链DNA 质粒载体，含有来自pBR322 质粒的复制起点(ori)，氨苄青霉素抗性基因(ampr)以及大肠杆菌â 半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码肽链的基因，在lacZ 基因中有一个多克隆位点(MCS)区段。当外源的DNA 片段插入到这些克隆位点使á 互补链破坏时，形成的是无活性的â-半乳糖苷酶，被转化的大肠杆菌细胞，在Xgal-IPTG 培养基上形成白色菌落，而没有外源DNA 插入的质粒转化大肠杆菌细胞后，在Xgal-IPTG 培养基上形成蓝色菌落。pUC 质粒载体比pBR322 具有更小的相对分子质量，而且由于rop 基因的缺失(其基因产物ROP 蛋白，控制质粒复制)，使得其拷贝数大增，每个细胞可达500-700 个拷贝，因此由pUC 质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA 分子。pUC18 和pUC19 的唯一差别是多克隆位点的方 向相反。Xgal(5 溴-4-氯-3-吲哚-â-D-半乳糖苷)可被â-半乳糖苷酶水解生成深兰色的5-溴-4-靛兰，IPTG(异丙基硫代â-D-半乳糖苷)可诱导â-半乳糖苷酶á-链的合成。适合于蓝白选择。3ë 噬菌体ë 噬菌体的基因组是长度约为50kb 的线性双莲DNA 分子。在其两端，各有一条由12 个核苷酸组成的互补粘性末端。当ë 噬菌体DNA 进入寄主细胞后，线性DNA 分子通过粘性末端的碱基配对而结合，形成环状DNA 分子。这种由粘性末端结合形成的双链区段为cos 位点。现用的ë 噬菌体载体都是在野生型基础上改造而成的。改建之后的常用载体有两类：插入型载体，具有一个可供外源DNA 插入的克隆位点，如ëgt10、ëgt11；替换型载体，具有成对的克隆位点，在两个位点之间的ëDNA 区段可被外源插入的DNA 片段取代，如charon4、charon10、charon35。插入型载体只能插入较小的外源DNA 片段，而替换型载体能插入较大的外源DNA 片段（20-24kb 左右）。当重组体DNA分子大于ë 噬菌体基因组105%或小于75%时，重组噬菌体的活力会大大下降，不能形成正常大小的噬菌斑，所以重组体DNA 分子长度应控制在包装限度范围内。ë 噬菌体重组体分子不具有抗生素抗性选择标记，主要是依据噬菌斑的形态学特征和Xgal-IPTG 显色反应来筛选重组子。cI 基因的存在将使噬菌体进入溶源状态，因此在培养基上形成的是混浊型的噬菌斑。cI 基因失活或缺失的噬菌体在培养基上形成清亮型噬菌斑。根据这个形态学特征可筛选重组体分子。许多ë 载体，如charon2、ëgt11 含有编码â 半乳糖苷酶基因lacZ（其中引入多克隆位点）。由这种载体感染的大肠杆菌lac-菌，涂布在含有IPTG 和Xgal 的培养基平板上，会形成蓝色噬菌斑。当外源DNA片段插入到这些克隆位点时，寄主细胞就会在Xgal-IPTG 培养基上形成无色噬菌斑，如果在替换型载体的可替换区段含有lacZ 基因序列，也会出现同样结果。4Cosmid 质粒黏粒载体本身长4-6kb，具有质粒和ë 噬菌体两种载体的性质，能像质粒一样复制及转化细菌，在细菌中其增殖与质粒复制一样，产生的重组子是菌落而不是噬菌斑，同时也具有ë 噬菌体的cos 位点，能与ë 噬菌体一样在体外被包装成病毒颗粒并感染宿主菌，但是由于在黏粒中克隆基因组文库要比在ë 噬菌体中困难得多，只有在靶基因过大，不能作为单个DNA 区段在ë 噬菌体载体中克隆增殖，或者要分离一系列跨过染色体DNA 特大区段的重叠克隆时，才使用黏粒载体。用于克隆大片段DNA 的 Cosmid 质粒：5酵母人工染色体定向克隆：两个粘性末端的序列不同，仅按照一个方向插入质粒。三外源基因导入宿主细胞外源基因导入原核细胞的常用方法有：转染，即用冰冷的CaCl2 处理后瞬间加热，将含有外源DNA的质粒导入感受态的宿主细胞；转化，即用噬菌体将外源DNA 导入感受态的宿主细胞；电穿孔法，即用脉冲高压电瞬间击穿细胞膜，将含有外源DNA 的质粒导入宿主细胞；ë 噬菌体的体外包装，将含有外源DNA 的ë 噬菌体DNA 与外壳蛋白在体外包装成噬菌体，可以大幅度提高转化率，包装蛋白有商品出售。外源基因导入酵母细胞的常用方法有：用蜗牛消化酶消化细胞壁，制成原生质体，再用CaCl2 和聚乙二醇处理，促进重组DNA 的吸收。外源基因导入动物细胞的常用方法有：磷酸钙共沉淀法；DEAE-葡聚糖或聚阳离子促进吸收法；脂质体转染法；电穿孔法；病毒转染法；显微注射法。外源基因导入植物细胞的常用方法有：用纤维素酶消化细胞壁，制成原生质体，再用CaCl2 和聚乙二醇处理，促进重组DNA 的吸收，也可使用电穿孔法和脂质体转染法；将外源DNA 插入Ti 质粒的T-DNA，借助土壤农杆菌将外源DNA 导入植物细胞；基因枪微弹射击法；显微注射法。四阳性克隆的筛选1快速裂解菌落鉴定分子大小从平板中直接挑取菌落裂解后，不需要内切酶消化，直接进行凝胶电泳，与载体DNA 比较迁移率，初步判断是否有插入片段存在，本方法适用于插入片段较大的重组子初步筛选。2内切酶图谱鉴定对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶(1 种或2 种)切割重组子释放出插入片段，对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片段和载体的大小。3Southern 印迹杂交为了进一步确定DNA 插入片段的正确性，在内切酶消化重组子，凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA 移至硝酸纤维膜上，再用放射性核素或非放射性标记的相应外源DNA 片段作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片段是否是所需的靶基因片段。4PCR 筛选重组子一些载体的外源DNA 插入位点两侧，存在恒定的序列，用相应的引物对小量抽提的质粒DNA 进行PCR 分析，不但可迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA 顺序分析。对于原核或真核系统表达型重组子，其插入片段的序列正确性是非常关键的，故有必要对重组子进行序列测定，DNA 序列分析现多采用自动测序仪完成。5菌落（或噬菌斑）原位杂交菌落或噬菌斑原位杂交技术是先将转化菌直接铺在硝酸纤维素薄膜或琼脂平板上，再转移到另一硝酸纤维素薄膜上，用核素标记的特异DNA 或RNA 探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆菌落。本方法能进行大规模操作，一次可筛选5×105-5×106 个菌落或噬菌斑，对于从基因文库中挑选目的重组子，是一项首选的方法。典型的细菌转化实验：第二节 基因的分离、合成和测序一目的基因的来源1基因组DNA 的非特异性断裂超声波处理基因组DNA 可得到300bp 左右的随机片段，高速组织捣碎器，控制一定的条件也能得到不同大小的DNA 片段，如将高分子量DNA1500r/m 捣碎30 分钟，可得到大约8kb 的DNA 片段。由机械处理产生的DNA 片段末端不一，断点随机，条件难以掌握，所以目前较少使用这种方法。2染色体DNA 的限制性内切酶解型限制性内切酶可专一识别并切割特定的DNA 顺序，产生不同类型的DNA 末端。若载体DNA 与插入片段用同一种内切酶消化，可以直接进行连接。内切酶识别的DNA 顺序长短与降解后DNA 产生的片段大小有直接关系。若识别顺序为4 个碱性对，则该顺序在DNA 链上出现的机率为44，即在碱基随机排列的前提下，每256 个碱基对就有一个切点。对于识别6 个核苷酸的限制性内切酶，其顺序出现的频率为46(4096)，可获得较大的DNA 片段，也可用于DNA 文库的建立。3通过mRNA 合成cDNA基因组DNA中重复顺序和假基因占有很大比重，克隆完整的基因比较困难。用mRNA反转录成cDNA，得到相应的双链cDNA，再进行克隆，获得较完整的连续编码顺序，容易在宿主细胞中表达。除建立cDNA 文库以外，对于一些高丰度表达、容易纯化的蛋白质，可以直接通过该蛋白质的单克隆抗体纯化该基因的核糖体，再分离该蛋白质的特异mRNA，直接反转录成cDNA，进行基因克隆，从而直接获得该特定基因的克隆，这是用染色体DNA 难以达到的克隆效果。4人工体外合成DNA 片段随着体外