啤酒酵母选育

1、啤酒酵母选育紫外诱变及其突变株的性能测试1 材料与方法1.1 材料菌种：四铃啤酒酵母 仪器：分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装 置、分析天平。培养基：麦芽汁培养基，麦芽汁固体培养基。（麦芽汁由四铃啤酒厂提 供）1.2 试验方法1.2.1 酵母菌的活化 取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶 130r/min 振荡培养，于281恒温培养箱培养14h,得到正常生长时期的酿酒酵母菌悬液。然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上，采纳28恒温培养14h，得到 完全活化的正常生长的酵母菌。1.2.2酿酿酒酵母菌对数生长期的测0.7悬液的制备菌液离心收集菌体，洗涤2次后，菌体悬浮于lOmL生理盐122.1 菌取1omL 水中，唏得菌悬液。接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中， 咅养，每隔2h取试管3个，放入冰箱，全部培养终止取活獰菌悬液各1摇匀，130r/min用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值，以空白的麦 芽汁培养液为对比，按照所彳得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。图1酿酒酵母菌的主怅曲线（此图视为参考）1.2.3紫外线诱变试验用麦芽汁液体培养基将处于对数

2、生长期的菌悬液稀释，使菌种的浓度 达到1x106个/mL。（此处菌悬液浓度的确定采纳三种方法：1.显微镜直截 了当计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法）备注：平板直截了当计数法：如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂 布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流淌，不易形成单菌落，且培养周 期长，耗时多，工作量大，然而也是我们的强项，能够锤炼大一的动手能 力。2：显微镜直截了当计数法：比较直观，我们能够直截了当显微观看， 多人工作计数。耗时较短，且工作量较小，同时我系其他实验组采纳此方 法计数，可供参考。3：光电比浊法：尽管绘制标准曲线要求较高，然而工作量较小，且一 次绘制好标准曲线好后，以后能够用，准确率较高。比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，能够校正方 案。实验步骤：打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳固。1取斜面菌苔一环于2OmL麦汁中混匀，281活化培养14h。2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min，弃上清液加入4mL 生理盐水洗涤，在电磁振荡仪上震荡10min左右，重复2次，制成5mL悬 液，用血球计数板在显微镜下直截了当计数，调整细

3、胞浓度。3取诱变前的ImL菌悬液进行适当稀释，分离出3个合适的稀释度倾 注琼脂平板，约为10-3、10-4、10-5，每一个梯度3 个平板，每一个平板加 0.2mL 菌液，进行培养后平板计数法，作为对比。4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中，加入一无菌磁力转子，置于磁力 搅拌器上。5 30W紫外灯下30cm处照耀，调整照耀时刻。此次预设为 0， 30， 45， 60， 90， 120， 180， 600.（单位 s）6取一定稀释梯度的紫外照耀菌液 0.1（视具体情形而定）用无菌涂布 棒涂布平均，每组做三个平行线培养记录菌落数，运算各照耀时刻下的致 死率。（选在 75%-80%）。致死率=未经照耀菌落数-紫外照耀菌落数未经紫外照耀菌落数7 挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养，然后重复 1-5 ， 再重复第 5 步，挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养， 连续进行 5次，281培养20h左右，运算其突变率和致死率。（上述时刻等数字视为参 考数值）1.2.3.1 初筛诱变后选择在麦芽汁固体培养基上生长良好，菌落呈中等大小、乳白 色、表面光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。

4、1.2.3.2 复筛供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵，测定发酵液中的双乙酰含 量并以此作为复筛的标准。同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母 的其它性能。双乙酰含量测定：初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml 120Bx麦芽汁发酵8d后， 测定发酵液中的双乙酰含量，选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次 发酵，将双乙酰含量明显降低的 4 株菌分不编号为 FB-E1、FB-E2、FB-E3 和 FB-E4 。结果见表 1表1 发酵液中双乙酰含量的比较菌株F B FB-E1 FB-E2 FB-E3 FB-E4双乙酰含量 （mg/L） 0.1233 0.0706 0.0926 0.0776 0.0870降低率（%）042.724.937.129.4（此处绘制表格样式视为参考）降低前驱物质a-乙酰乳酸的生产量措施：改良酵母菌种提升麦汁中 a -氨基氮含量，能够抑制合成酶的活性2加速双乙酰的还原措施：提升酵母的细胞密度（增大酵母菌的接种量） 提升还原温度（封罐后高温还原）限制后期酵母的出芽率（封罐）国标中关于啤酒中双乙酰的量的要求二级啤酒：0.2mg/L 级啤酒：0.13mg/

5、L方法：国标 GB4927-2001 检测培养条件：恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量。原理：双乙酰的测定方法采纳比色法。邻苯二胺比色法是连二酮类都 能发生显色反应的方法，因此，此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量， 结果偏高。但此法快速简便。用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加邻苯 二胺，形成2，3二甲基喹喔琳，其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸取 峰，可进行定量测定。1仪器：带有加热套管的双乙酰蒸馏器，蒸汽发生瓶Q000mL或3000 mL)或者锥形瓶，平底烧瓶，容量瓶25mL2 试剂和溶液盐酸溶液(4moL/L)，邻苯二铵溶液：10g/L (称取邻苯二铵0.1g用盐 酸溶液溶解并定容至10mL摇匀，放于阴暗处，注意此溶液即用即配)消泡剂3 实验步骤(1) 把双乙酰蒸馏器安装好，把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。(2) 将内装2.5mL蒸馏水的容量瓶(或量筒)放于冷凝器下，使出口尖端 浸没在水面下，外加冰水冷却。(3) 加热蒸汽发生器至沸，通汽加热夹套，备用。于100mL量筒中加入24滴消泡剂，再注入51左右未除气啤酒10 0mL。(5) 待夹套蒸馏器下端冒大汽时，打开

6、进样口瓶塞，将啤酒迅速注入蒸 馏器内，再用约10mL蒸馏水冲洗量筒，同时倒入，迅速盖好进样口塞子, 用水封口。(6) 待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时，将排气夹子夹住，开始蒸馏，到 馏出液接近25mL时取下容量瓶，用水定容至25mL，摇匀(蒸馏应在3分钟 内完成 )。（7）分不吸取馏出液10mL于两支比色管中。一管作为样品管加入0.5mL 邻苯二胺溶液，另一管不加作空白，充分摇匀后，同时置于暗处放置20-30分钟，然后于样品管中加2mL4N盐酸溶液，于空白管中加2.5mL4N盐 酸溶掖，混匀。（8）在335nm波长处，用1cm比色皿以空白作对比测定样品吸光度。 运算：双乙酰（mg/L）=A335X2.4 （用20mm石英比色皿时，吸光度与双乙酰的换算系数）注：若用 20mm 的石英比色皿则换算系数则为 1.21.2.4不同菌株的发酵性能测试（CO2失重法） 将发酵摇瓶置于26度恒温环境中，每天称重1次（直至日失重小于0.5g为止），因每瓶用于发酵的麦芽汁体积相同，因此只需运算发酵后单位时 刻内CO2的开释量，发酵6d,以CO2产生量为纵坐标，发酵时刻为横坐 标，绘制C02产生量曲线。1.2

7、.6不同菌株发酵发酵液中残留总糖含量测定从8个发酵后的发酵瓶中各取0.2mL发酵液并稀释500倍，用硫酸-苯 酚法测定发酵液中残留总糖的含量。附录：硫酸-苯酚法1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖20mg，蒸馏水准确定容500mL得到0.04 mg/L 的葡萄糖液。2）试剂1）浓硫酸：分析纯， 95.5%2）80%苯酚： 80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解， 可置冰箱中避光长期储存。3）6%苯酚：临用前以 80%苯酚配制。（每次测定均需现配）4）15%三氯乙酸（15%TCA）： 15克TCA加85克水使之溶解，可置 冰箱中长期储存。5）5%三氯乙酸（5%TCA）： 25克TCA加475克水使之溶解，可置冰 箱中长期储存。6）6mol/L氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。7）6mol/L 盐酸表 1 标准曲线的制作步骤管号01234678葡萄糖0.00.40.60.81.01.21.41.61.8蒸馏水2.01.61.41.21.00.80.60.40.2苯酚液1.01.01.01.01.01.01.01.01.0浓硫酸5.05.05.05.05.

8、05.05.05.0 5.0取8支洁净的具塞试管按表2方法操作，摇匀后放置5min，置沸水浴中加 热15min,取出迅速冷却至室温，以0号作为空白调零，在最大吸取波长处测定 吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL）,吸光度Y为纵坐标，从而来 绘制标准曲线。1 制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml 容量瓶中，加水至刻度，分不吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8， 各以蒸馏水补至2.0m 1,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却， 室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空 白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。2样品含量测定：取样品1克（湿样）加1 mL15%TCA （三氯醋酸） 溶液研磨，再加少许5%TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再 加少许5%TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到 入离心管。注意：总的溶液不要超出 10毫升。（既不要超出离心管的容量）。 离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次 各5

9、分钟取上清液到 25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L盐酸之后摇匀，在961水浴锅 中水浴2小时。定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2ml的样品液，以蒸馏 补至2.0m 1，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20 分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对比。以标准曲线运算多糖 含量。1.2.7 不同菌株产酒精能力（酒精度）测试快速氧化法乙醇在酸性条件下,通过量的、一定浓度的重铬酸钾作用，氧化生成醋 酸。再将剩余的的重铬酸钾经硫代硫酸钠还原。由反应过程中，通过消耗 的硫代硫酸钠的量运算酒精含量。试剂：重铬酸钾溶液、硝酸溶液、碱性碘化钾溶液、淀粉溶液、硫代 硫酸钠标准溶液方法：在蒸馏器的接收瓶中，加入10.00ml重铬酸钾溶液和25ml硝酸 溶液。并将空气冷凝器的出口插入此溶液中。在蒸馏瓶中加入12ml水和1. 00ml试样。接好装置，迅速加热至沸，并连续煮沸3分钟，蒸馏即告完成。 在同意瓶中，加入300ml水、10ml碱性碘化钾溶液及10ml淀粉溶液，在 电磁搅拌器搅拌下，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡青色的淀粉终点。通 过如下公式运算酒精含量。酒精（%， V/V）=（20.00-0.6575V）/Vs式中V硫代硫酸钠标准溶液滴定量Vs试样取样量方法

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