啤酒酵母选育

啤酒酵母选育紫外诱变及其突变株的性能测试1 材料与方法1.1 材料菌种：四铃啤酒酵母 仪器：分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装 置、分析天平。培养基：麦芽汁培养基，麦芽汁固体培养基。（麦芽汁由四铃啤酒厂提 供）1.2 试验方法1.2.1 酵母菌的活化 取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶 130r/min 振荡培养，于281恒温培养箱培养14h,得到正常生长时期的酿酒酵母菌悬液。然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上，采纳28恒温培养14h，得到 完全活化的正常生长的酵母菌。1.2.2酿酿酒酵母菌对数生长期的测0.7悬液的制备菌液离心收集菌体，洗涤2次后，菌体悬浮于lOmL生理盐122.1 菌取1omL 水中，唏得菌悬液。接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中， 咅养，每隔2h取试管3个，放入冰箱，全部培养终止取活獰菌悬液各1摇匀，130r/min用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值，以空白的麦 芽汁培养液为对比，按照所彳得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。图1酿酒酵母菌的主怅曲线（此图视为参考）1.2.3紫外线诱变试验用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释，使菌种的浓度 达到1x106个/mL。（此处菌悬液浓度的确定采纳三种方法：1.显微镜直截 了当计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法）备注：平板直截了当计数法：如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂 布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流淌，不易形成单菌落，且培养周 期长，耗时多，工作量大，然而也是我们的强项，能够锤炼大一的动手能 力。2：显微镜直截了当计数法：比较直观，我们能够直截了当显微观看， 多人工作计数。耗时较短，且工作量较小，同时我系其他实验组采纳此方 法计数，可供参考。3：光电比浊法：尽管绘制标准曲线要求较高，然而工作量较小，且一 次绘制好标准曲线好后，以后能够用，准确率较高。比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，能够校正方 案。实验步骤：打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳固。1取斜面菌苔一环于2OmL麦汁中混匀，281活化培养14h。2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min，弃上清液加入4mL 生理盐水洗涤，在电磁振荡仪上震荡10min左右，重复2次，制成5mL悬 液，用血球计数板在显微镜下直截了当计数，调整细胞浓度。3取诱变前的ImL菌悬液进行适当稀释，分离出3个合适的稀释度倾 注琼脂平板，约为10-3、10-4、10-5，每一个梯度3 个平板，每一个平板加 0.2mL 菌液，进行培养后平板计数法，作为对比。4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中，加入一无菌磁力转子，置于磁力 搅拌器上。5 30W紫外灯下30cm处照耀，调整照耀时刻。此次预设为 0， 30， 45， 60， 90， 120， 180， 600.（单位 s）6取一定稀释梯度的紫外照耀菌液 0.1（视具体情形而定）用无菌涂布 棒涂布平均，每组做三个平行线培养记录菌落数，运算各照耀时刻下的致 死率。（选在 75%-80%）。致死率=未经照耀菌落数-紫外照耀菌落数未经紫外照耀菌落数7 挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养，然后重复 1-5 ， 再重复第 5 步，挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养， 连续进行 5次，281培养20h左右，运算其突变率和致死率。（上述时刻等数字视为参 考数值）1.2.3.1 初筛诱变后选择在麦芽汁固体培养基上生长良好，菌落呈中等大小、乳白 色、表面光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。1.2.3.2 复筛供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵，测定发酵液中的双乙酰含 量并以此作为复筛的标准。同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母 的其它性能。双乙酰含量测定：初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml 120Bx麦芽汁发酵8d后， 测定发酵液中的双乙酰含量，选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次 发酵，将双乙酰含量明显降低的 4 株菌分不编号为 FB-E1、FB-E2、FB-E3 和 FB-E4 。结果见表 1表1 发酵液中双乙酰含量的比较菌株F B FB-E1 FB-E2 FB-E3 FB-E4双乙酰含量 （mg/L） 0.1233 0.0706 0.0926 0.0776 0.0870降低率（%）042.724.937.129.4（此处绘制表格样式视为参考）降低前驱物质a-乙酰乳酸的生产量措施：改良酵母菌种提升麦汁中 a -氨基氮含量，能够抑制合成酶的活性2加速双乙酰的还原措施：提升酵母的细胞密度（增大酵母菌的接种量） 提升还原温度（封罐后高温还原）限制后期酵母的出芽率（封罐）国标中关于啤酒中双乙酰的量的要求二级啤酒：0.2mg/L 级啤酒：0.13mg/L方法：国标 GB4927-2001 检测培养条件：恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量。原理：双乙酰的测定方法采纳比色法。邻苯二胺比色法是连二酮类都 能发生显色反应的方法，因此，此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量， 结果偏高。但此法快速简便。用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加邻苯 二胺，形成2，3二甲基喹喔琳，其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸取 峰，可进行定量测定。1仪器：带有加热套管的双乙酰蒸馏器，蒸汽发生瓶Q000mL或3000 mL)或者锥形瓶，平底烧瓶，容量瓶25mL2 试剂和溶液盐酸溶液(4moL/L)，邻苯二铵溶液：10g/L (称取邻苯二铵0.1g用盐 酸溶液溶解并定容至10mL摇匀，放于阴暗处，注意此溶液即用即配)消泡剂3 实验步骤(1) 把双乙酰蒸馏器安装好，把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。(2) 将内装2.5mL蒸馏水的容量瓶(或量筒)放于冷凝器下，使出口尖端 浸没在水面下，外加冰水冷却。(3) 加热蒸汽发生器至沸，通汽加热夹套，备用。于100mL量筒中加入24滴消泡剂，再注入51左右未除气啤酒10 0mL。(5) 待夹套蒸馏器下端冒大汽时，打开进样口瓶塞，将啤酒迅速注入蒸 馏器内，再用约10mL蒸馏水冲洗量筒，同时倒入，迅速盖好进样口塞子, 用水封口。(6) 待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时，将排气夹子夹住，开始蒸馏，到 馏出液接近25mL时取下容量瓶，用水定容至25mL，摇匀(蒸馏应在3分钟 内完成 )。（7）分不吸取馏出液10mL于两支比色管中。一管作为样品管加入0.5mL 邻苯二胺溶液，另一管不加作空白，充分摇匀后，同时置于暗处放置20-30分钟，然后于样品管中加2mL4N盐酸溶液，于空白管中加2.5mL4N盐 酸溶掖，混匀。（8）在335nm波长处，用1cm比色皿以空白作对比测定样品吸光度。 运算：双乙酰（mg/L）=A335X2.4 （用20mm石英比色皿时，吸光度与双乙酰的换算系数）注：若用 20mm 的石英比色皿则换算系数则为 1.21.2.4不同菌株的发酵性能测试（CO2失重法） 将发酵摇瓶置于26度恒温环境中，每天称重1次（直至日失重小于0.5g为止），因每瓶用于发酵的麦芽汁体积相同，因此只需运算发酵后单位时 刻内CO2的开释量，发酵6d,以CO2产生量为纵坐标，发酵时刻为横坐 标，绘制C02产生量曲线。1.2.6不同菌株发酵发酵液中残留总糖含量测定从8个发酵后的发酵瓶中各取0.2mL发酵液并稀释500倍，用硫酸-苯 酚法测定发酵液中残留总糖的含量。附录：硫酸-苯酚法1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖20mg，蒸馏水准确定容500mL得到0.04 mg/L 的葡萄糖液。2）试剂1）浓硫酸：分析纯， 95.5%2）80%苯酚： 80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解， 可置冰箱中避光长期储存。3）6%苯酚：临用前以 80%苯酚配制。（每次测定均需现配）4）15%三氯乙酸（15%TCA）： 15克TCA加85克水使之溶解，可置 冰箱中长期储存。5）5%三氯乙酸（5%TCA）： 25克TCA加475克水使之溶解，可置冰 箱中长期储存。6）6mol/L氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。7）6mol/L 盐酸表 1 标准曲线的制作步骤管号01234678葡萄糖0.00.40.60.81.01.21.41.61.8蒸馏水2.01.61.41.21.00.80.60.40.2苯酚液1.01.01.01.01.01.01.01.01.0浓硫酸5.05.05.05.05.05.05.05.0 5.0取8支洁净的具塞试管按表2方法操作，摇匀后放置5min，置沸水浴中加 热15min,取出迅速冷却至室温，以0号作为空白调零，在最大吸取波长处测定 吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL）,吸光度Y为纵坐标，从而来 绘制标准曲线。1 制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml 容量瓶中，加水至刻度，分不吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8， 各以蒸馏水补至2.0m 1,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却， 室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空 白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。2样品含量测定：取样品1克（湿样）加1 mL15%TCA （三氯醋酸） 溶液研磨，再加少许5%TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再 加少许5%TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到 入离心管。注意：总的溶液不要超出 10毫升。（既不要超出离心管的容量）。 离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次 各5分钟取上清液到 25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L盐酸之后摇匀，在961水浴锅 中水浴2小时。定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2ml的样品液，以蒸馏 补至2.0m 1，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20 分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对比。以标准曲线运算多糖 含量。1.2.7 不同菌株产酒精能力（酒精度）测试快速氧化法乙醇在酸性条件下,通过量的、一定浓度的重铬酸钾作用，氧化生成醋 酸。再将剩余的的重铬酸钾经硫代硫酸钠还原。由反应过程中，通过消耗 的硫代硫酸钠的量运算酒精含量。试剂：重铬酸钾溶液、硝酸溶液、碱性碘化钾溶液、淀粉溶液、硫代 硫酸钠标准溶液方法：在蒸馏器的接收瓶中，加入10.00ml重铬酸钾溶液和25ml硝酸 溶液。并将空气冷凝器的出口插入此溶液中。在蒸馏瓶中加入12ml水和1. 00ml试样。接好装置，迅速加热至沸，并连续煮沸3分钟，蒸馏即告完成。 在同意瓶中，加入300ml水、10ml碱性碘化钾溶液及10ml淀粉溶液，在 电磁搅拌器搅拌下，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡青色的淀粉终点。通 过如下公式运算酒精含量。酒精（%， V/V）=（20.00-0.6575V）/Vs式中V硫代硫酸钠标准溶液滴定量Vs试样取样量方法