高新技术论文
29页1、随着生命科学和化学的不断发展,人们对生物体的认知已经逐渐深入到微观水平。从 单个的生物体到器官到组织到细胞,再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平,人们意识到可 以通过检测分子水平的线性结构(如核酸序列),来横向比较不同物种,同物种不同个体, 同个体不同细胞或不同生理(病理)状态的差异。这就为生物学和医学的各个领域,提供了 一个强有力的技术平台。目前,常用的分子生物学技术有如下几种1PCR单链构象多态性分析PCR-单链构象多态性分析(PCR- single strand conformation analysis,PCR- SSCP) 是近年来在基因突变检测中运用最广泛的方法之一PCR- SSCP技术凭借突变可引起单链 DNA三级构象改变,通过观察单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率漂移来判断突 变。样品经PCR扩增后,其产物经变性后可以产生2条单链,如果存在基因突变,哪怕是 一个碱基的异常,单链的构象也会发生变化,正常与突变的DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电 泳(PAGE)中,可以显现出不同的带型,从而确定野生型和突变型,PCR- SSCP分析的主 要优点是简易且敏感性较高。但是该技术
2、不能确定突变的部位和性质。PCR- SSCP突变检 测敏感性随PCR产物长度的增加而降低,一般用于检测较小外显子的突变。有时由于单个 核苷酸变化所引起的构象改变很小,用PAGE电泳就可能无法检出,在PCR产物或待测 DNA小于200 bp时,PCR- SSCP分析能够检测出70% 95%的突变。如果以毛细管电泳 代替PAGE,则可大为提高突变检测的效率。Wallace1997 年提出将 PCR- SSCP 和异源 DNA 双链分析(heteroduplex analysis,HA)相结合,称之为SSCP/ HA,部分PCR产物经变性进行SSCP分析以了解 是否具有突变,其余PCR产物直接用于电泳,以检出含有突变的异源DNA双链,电泳凝 胶经银染,单链DNA所形成的带为橘黄或棕色,而双链DNA则表现为灰黑色。该综合手 段可以单链构型多态性和异源双链构型分析两个不同的层次检出突变,是一种经济、迅速的 突变检测手段,但无法提供突变位置的信息。PCR- SSCP有许多改进技术,如RNA单链构象多态性法(PCR- rSSCP)、双脱氧测 序单链片段构象多态分析(PCR- ddF)、限制酶指纹技术
3、(PCR- REF)等。PCR- rSSCP 法依据RNA构象对单个碱基替代更敏感的原理,在PCR引物上加上某类启动子,通过转 录的RNA构象体的电泳迁移差异进行突变鉴别。PCR- ddF法把PCR产物转录,将转录 物用反转录酶进行Sanger双脱氧终止测序反应,通过观察非变性胶上经解链处理所产生的 单链漂移、突变后终止片段的获得与缺失来判断突变。PCR- REF法将RFLP和SSCP 技术优势组合,将PCR扩增的待测片段用5 6种限制酶依次消化,混合并进行末端标记, 最后经变性处理并在非变性凝胶上电泳分离,从而获得来自片段长度和片段构象的双重突变 信息。变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)利用由碱基序列 所决定的DNA片段溶解度或变性度的差异,达到分离野生型与突变型DNA片段的目的, 该手段分辨率达一个碱基。当DNA双链沿变性剂浓度梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶迁移时,DNA分子中解链温度(Tm)低的部分逐渐变性解链。一般总是错配碱基部分的异源双链Tm 最低,最容易解链,其次是富含AT碱基对的部位,富含
4、GC碱基对的部位Tm值较高所以 解链较难。因此,正常DNA双链和异源双链在梯度变性胶中电泳时,异源双链总是先解链。 将PCR产生的双链DNA在浓度递增的尿素和甲酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,当某一 DNA片段迁移到变性剂浓度与其最低Tm相当的位置时,该片段低温解链部分的双链打开, 部分解链导致DNA迁移速度明显下降,观察样品的迁移率变化即可判断是否存在变异。 DGGE敏感性高,即便异源双链中仅含一个错配碱基,在电泳时也可分辨其迁移率的改变。 DGGE方法的单碱基突变检出率在DNA片段长度600 bp以内可以达到95%。DGGE的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于 最高Tm的变性剂浓度的位置,相应的DNA片段可能全部解链,使试验无法检出存在于高 Tm DNA片段中的碱基替换。为了解决此问题,可以在一个PCR引物的5 端设计一段富 含GC的尾巴,从而使PCR扩增产物的一端富含GC碱基对,保证了绝大多数DNA片段 不会发生完全解链,在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链,这一改进 使DGGE的突变检出率接近100%,但DGGE只能检测突变是否存在
《高新技术论文》由会员鲁**分享,可在线阅读,更多相关《高新技术论文》请在金锄头文库上搜索。
2022年普通脚手架工(建筑特殊工种)考试内容及考试题库含答案参考82
能源公司工程技术人员述职报告
(精选汇编)2023高一军训心得体会汇总8篇
15级高一数学解三角形等差数列练习题答案
经典的说说(精选15篇)
学校2022年度军训个人心得
LG四核手机武装云技术携手BOX玩转互联生活
给排水设备供货服务方案
简单版租房协议范本四篇
辽宁省大连市一〇三中学2018-2019学年高一政治10月月考试题(无答案)
通道桥桥面铺装施工方案
生产桥施工组织设计
2023年学校财务上半年总结(8篇)
医生述职报告模板汇编六篇
高考化学专题复习无机框图推断教师版
云南省安全生产条例
秀山高级中学高三地理训练题一
环境保护工作总结(4篇).doc
1你像一颗种子
售后服务标准体系
2022-07-13 3页
2023-03-08 3页
2023-12-29 3页
2023-04-29 22页
2022-10-08 17页
2023-04-12 4页
2023-01-17 7页
2023-09-01 3页
2024-01-14 3页
2023-09-21 9页