引物设计实例分析GFP融合蛋白引物设计引物设计基本原则引物
17页1、引物设计实例分析(GFP融合蛋白引物设计)引物设计基本原则引物长度(primer length)产物长度( product length)序列 Tm 值 ( melting temperature)G+C 含量( composition)引物二聚体及发夹结构( duplex formation and hairpin)阅读框1. 引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其 延伸温度大于74C,即Taq酶的最适温度2. 产物的长度扩增片段长度为 100600 碱基对。3. Tm 值引物的 Tm 值一般控制在 55-60 度, 尽可能保证上下游引物的 Tm 值一致,一般不超过 2 度。 如果引物中的 G+C 含量相对偏低,则 可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度。Tm=2( A+T) +4( C+G)4. 引物的 GC 含量有效引物中(G+C)的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。5. 引物自身引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR
2、1pcDNA3,lpcDNA3.1NR1的编码序列KOOObp)121 ggggc+cc+a gagaacccgg gggcgc+tga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgagg+cg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg c+gtgcccgg agctca+gag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gc+gagcacg cgcaagcatg aacagatg+t 361 ccgcgaggca gtaaoccagg ccaataagcg ac-acggctct tggaagat口匚 agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acaga+ggcc c+gtcag+gt gtgaggacct 481 ca+ctctagc caggtc+acg c+a+cc+agt tagccaccc
3、g cctac+ccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtc+cct acacagctgg ctictacaga atccc+gtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatc+act ctgacaagag ta+ccacc+g agt+tccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc cacc-ag+cca gcg+ctgg+t tgag口tg口均 cgagtctac口 ac+ggaacca 721 catca+cc+g c+ggtcccg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gettggagac 781 g+tge+ggag goaegggagt ccaaggcag口 gacgtgctg cagt+tgacc caggaaccaaM鱼为:言号肽莹鱼为BamHIW切位也下划线标出酶切位点罚阅读框GFP 序列(TOObp)4TGSTG妬CA妬 G&CGAGGAGC TGTTCACCGG GfiTGTGCCC ATCCTfi&TCfi A&CTS6ACGG C&ACffTAAAC G&CC
4、ACAAffT TCAGCGTGTC CGGCGAGGC GAGGCGATG CCACCTACGG CAASCTS4CC CTSAA6TTCA TCTSCACCAC CS&CAASCT& CCCGTfrCCCT G&CCCACCrr CGT&ACCACC TTCGGCT/ACG (JCCT6CA6T6 CTTC6CCC&C TACCCC6ACC ACAJ6AA6CA &CAC6ACTTC TTCAA6TCCG CCATSCCCGA AS&CTAC&TC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AG盘CCC&C&5 C&A&ffTSAAG TTC&A&6C& ACACCCTOST &AACCGC/ATC fr/AGCTCAAGG SCATCGACTT CAAGGAGAC 66CAACATCC T6666CACAA 6CTS6A6TAC AACTACAACA GCCACA/AC6T CTATATCATS GCCGMAAGC AGAAGAACGfi CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGASGAC CACT
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