牡蛎精氨酸激酶过敏原小鼠过敏模型的建立与分析.docx

牡蛎精氨酸激酶过敏原小鼠过敏模型的建立与分析在主要的过敏食物中，贝类、鱼、花生和坚果更有可能引发危及 生命的全身过敏反响［1］贝类过敏在西方国家中很常见，且逐渐在亚 洲局部地区的儿童和成人中变得普遍［2］目前已发现6种贝类过敏 原，包括原肌球蛋白、肌浆钙结合蛋白、精氨酸激酶、磷酸丙糖异构 酶、肌浆蛋白轻链和肌钙蛋白［3-7］抗原首次进入机体后会诱导B 细胞产生免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)抗体，IgE与肥大细胞 外表的Fc e R I受体结合，使机体处于致敏状态当机体再次暴露于 相同抗原时，致敏细胞上的IgE会与其结合并导致肥大细胞脱颗粒, 释放组胺、类花生酸、蛋白酶和其他趋化和促炎细胞因子等炎症介质, 这些介质会募集白细胞，同时引起平滑肌收缩、血管扩张、黏液高分 泌和血管通透性增加等生理病理学变化，这也是过敏病症的发病机制 ［8-9］ o有证据说明，牡蛎的摄入、皮肤和黏膜接触以及雾化牡蛎蛋白 的吸入可导致患者出现多种临床病症［10T2］,而牡蛎中的精氨酸激 酶(arginine kinase, AK)也被验证为过敏原过敏原致敏性可以通过比拟序列同源性、IgE结合、血清检测、 也许是因为过敏反响产生许多嗜酸性粒细胞，进入肾脏后使BALB/c 小鼠的器官发生病变。

a-肝脏HE染色；b-空肠HE染色；c-脾脏HE染色；d-肾脏HE染 色；e-空肠甲苯胺蓝染色；「对照组；2-实验组图7器官HE与甲苯胺蓝染色结果Fig. 7 Results of organ HE and toluidine blue staining空肠组织经甲苯胺蓝染色后如图7-e所示,肥大细胞颗粒呈蓝紫 色,胞核为蓝色对照组的小鼠肠道（图7-el）固有层肥大细胞较少、 胞膜完整、轮廓清晰，只有很小一局部脱颗粒，而模型组的肠（图7-e2） 固有层肥大细胞增加，很多肥大细胞脱颗粒后胞膜破损、轮廓模糊 肥大细胞是I型过敏反响的重要效应细胞,IgE由B细胞受抗原刺激 后分泌，肥大细胞外表的Fc e R I受体能够结合IgE的Fc片段，当抗 原再次入侵时，IgE的Fab片段识别和结合抗原，抗原、IgE和Fc £ R I 之间的交联导致肥大细胞释放颗粒［22-23］所以肥大细胞脱颗粒是 过敏反响研究的主要阶段，其数量及脱颗粒情况能够良好的反映组织 过敏情况病理观察说明实验组BALB/c小鼠空肠已产生明显的过敏 现象3结论 由于经济全球化和人类饮食结构的改变，牡蛎引起的过敏性疾病 发病率正逐渐增加,这对人们的身体健康和生活质量形成了极大的威 胁。

本研究利用天然牡蛎AK通过经口灌胃与腹腔注射结合并添加CTB 佐剂的方式致敏BALB/c小鼠，同时从表型过敏级数、体重方面证明实 验组小鼠已产生过敏反响，而且也许因为过敏反响使脏器受到损伤影 响了小鼠的消化吸收，导致局部体重比对照组低，实验组血项指标均 呈现升高趋势另外，免疫期间模型组tlgE和slgE水平也显著增多, 组织病理学分析结果说明模型组脏器均出现组织损伤，空肠肥大细胞 脱颗粒现象严重本实验成功建立并分析了牡蛎AK小鼠致敏模型, 获得了 AK动物致敏血清，并从整体动物水平和形态学角度证明了牡 蛎AK的致敏性通过AK建立BALB/c小鼠致敏模型对研究食物过敏 的致敏机制及临床上预防及治疗食物过敏具有重要的理论意义接下 来将建立细胞模型并对Th2型淋巴细胞水平及其相关细胞因子的质量浓度和通路进行详细研究消化率和稳定性来评估，目前虾、蟹等过敏原的研究主要集中在这些 方向,但合适的动物模型能更直接地确定蛋白质的过敏反响［13］,但 至今未见牡蛎AK动物致敏模型的相关报道过敏食物评价的常用动 物模型有BALB/c小鼠、棕色挪威大鼠、豚鼠等,BALB/c小鼠体积小, 繁殖周期短，过敏原刺激后偏向Th2型细胞应答且可以产生高效价的 IgE,所以选择该品系小鼠为IgE介导过敏反响的研究对象［14-15］。

小鼠的给药途径包括口服灌胃、腹腔注射和表皮致敏，口服灌胃能更 好地模拟人体经口摄入食物过敏原的实际情况，不过容易诱导免疫耐 受研究发现霍乱毒素会使IL-4、IL-5显著上升，而IL-2. IFN-Y 基本无变化，并且能选择性发生以Th2为主的过敏反响，所以将它作 为黏膜佐剂可有效克服耐受现象［16］综上所述，本实验利用提取纯 化的牡蛎AK和无毒的霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit, CTB) 致敏雌性BALB/c小鼠，通过观察BALB/c小鼠的全身主动过敏反响及 体重，测定其血清中总IgE(tlgE)、特异性IgE(sIgE)水平和血浆中血 项含量的变化，对空肠、肝脏、脾脏和肾脏进行苏木精-伊红 (hematoxylin-eosin,HE)染色后观察病理变化，对空肠进行甲苯胺蓝染色来观察肥大细胞脱颗粒情况，初步建立牡蛎AK BALB/c小鼠过敏模型，为理解贝类过敏的有关免疫机制和研发预防及治疗食物过敏的 药物及治疗策略提供有价值的依据1材料与方法实验材料雌性BALB/c小鼠,6周龄,30只，维通利华动物公司，许可证号为 SYXK（京）2022-0033；牡蛎AK经过提取纯化获得；小鼠IgE酶联免疫 试剂盒，上海酶联生物科技；HRP标记的山羊抗小鼠IgE、抗 凝剂EDTA-K2、TMB显色液、重组霍乱毒素B亚基，碧云天公司。

以下 所有实验得到中国食品发酵工业研究院福利伦理委员会的批准（批准 文号：2022—0002） o实验方法1.1 . 1 BALB/c小鼠的致敏雌性BALB/c小鼠适应1周后将其随机分为实验组（20只）和PBS 对照组（10只），致敏前取血作为阴性血清使用口服灌胃与腹腔注射 牡蛎AK两种方式对实验组小鼠进行致敏（如图1）：在第0、8、16、 24、32、40天，实验组每只灌胃含有10 ugCTB及600 口 g AK的200 口 LPBS进行致敏；在第4、12、20、28、36天腹腔注射200 uL相 同剂量的AK和CTB在第45天用6 mg/mL的AK（200 uL）分别进行 灌胃和腹腔注射激发对照组灌胃等体积PBS （pH 7. 4）,步骤相同 分别于第16、28、36、40、45天内取血，离心收集血清，用于检测tlgE、 slgE；同时于第16、36、45天取血于7. 5% EDTA-K2抗凝管中，离心 收集血浆并冷冻于-80寸，用于测定血项水平的变化图1 BALB/c小鼠的致敏流程Fig. 1 Sensitization procedure of BALB/c mice1. 2. 2 BALB/c小鼠的全身主动过敏反响评估在第45天通过灌胃和腹腔注射高浓度牡蛎AK进行激发,激发后 20〜60 min进行体温测量，仔细观察小鼠全身过敏反响现象，同时根 据过敏评分表(表1)确定其表型过敏级数[17-18] o表1过敏反响级数Table 1 Allergy reaction grade平均过敏级数到达2级即确定发生表型过敏反响。

平均反响级数 和过敏率按公式(1)(2)计算：(1)式中：平均过敏级数；Ad,过敏级数；RA,过敏率，版n,过敏动物 数量；N,总动物数量1.2.3 BALB/c小鼠体重和血项指标变化致敏期间每2周称体重，计算平均体重第16、36、45天分别取 血于含有抗凝剂EDTA-K2的抗凝管中，使用血细胞分析仪对血浆中白 细胞、中性粒细胞和嗜酸性细胞这3种血项指标进行计数1. 2. 4 tlgE、slgE水平的检测利用间接酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测量BALB/c小鼠血清中slgE,用质量浓度为50 u g/mL 的牡蛎AK包被96孔板,49孵育过夜；添加300 uL/孔的5%脱脂奶 粉（质量分数，下同）372封闭1 h；再取100 UL 2%脱脂奶粉稀释的 BALB/c小鼠血清（1 ： 5）加入孔中，室温下孵育3 h；每孔添加100 u L HRP标记的山羊抗小鼠IgE（l ： 2 000）,37 ℃孵育1 h；用200 uLTMB 避光孵育20 min,然后添加50 uL 2 mol/L的H2S04溶液终止反响, 用酶标仪于450 nm测量0D值。

每两步之间都用PBST洗涤4次，所有 实验均重复3次使用ELISA试剂盒对BALB/c小鼠血清tlgE水平进 行测定1.5.5 BALB/c小鼠脏器、肠道病理学分析第45天激发采血后，处死小鼠，取其空肠、肝脏、脾脏、肾脏, 放入10%的多聚甲醛固定后修剪；用不同浓度梯度的乙醇进行脱水处 理，石蜡包埋后切片并进行HE染色，用显微镜观察组织形态；空肠甲 苯胺蓝染色后观察其肥大细胞脱颗粒现象1.5.6 统计学分析使用统计软件SPSS及OriginPro 8. 0处理实验数据，组间检验采用t检验,P0. 01差异极显著（用**表示）;P0. 05差异显著（用*表示）2结果与分析1 BALB/c小鼠的全身主动过敏反响结果第45天口服激发30 min后,实验组表现出0〜4级过敏病症（图 2）,其中有7只BALB/c小鼠不断对鼻子、耳朵、头周围及腹部进行抓 挠，有5只眼或口周围出现浮肿且毛发竖立；4只经常喘息、侧卧，有 3只对外界刺激反响迟钝并伴有颤抖病症，仅有1只无明显病症；对 照组BALB/c小鼠均未出现过敏病症尽管小鼠在不同过敏级别的数 量上存在一些差异，但说明通过灌胃和腹腔注射AK的BALB/c小鼠从 表型来看发生了过敏反响，且过敏率为95%O图2 BALB/c小鼠的过敏反响级数Fig. 2 Allergic reaction level of BALB/c mice2 BALB/c小鼠体重和血项指标变化2. 2. 1 BALB/c小鼠体重变化体重变化情况如图3所示，所有BALB/c小鼠体重均逐渐增长，但 与对照组相比，实验组体重增加缓慢。

在0〜14d内差异不明显，之后 实验组小鼠体重明比对照组轻，第42天两者平均体重差约0.5 go这 可能是因为过敏反响使其消化吸收系统功能紊乱，影响了小鼠的健康 状态，所以体重增长趋势平缓图3 BALB/c小鼠体重变化Body weight changes of BALB/c mice2. 2. 2 BALB/c小鼠血项指标变化情况当同种过敏原再次进入处于致敏状态的机体时，机体内细胞会随 之产生相应的应激反响，从而引起白细胞数目及分类的变化白细胞 是不均一的细胞群,按照其形态、功能和来源部位分为：粒细胞、单 核细胞和淋巴细胞，粒细胞包括中性粒细胞（杆状核及分叶核）、嗜酸 性粒细胞和嗜碱性粒细胞，不同类型的白细胞以不同形式在机体中发 挥防卫作用［19］ o从表2可知，随着致敏时间的增加，实验组小鼠白细 胞数量也逐渐增加，而对照组基本无变化，在第36、45天呈现出显著 性升高，这说明BALB/c小鼠在免疫期间一直处于过敏状态实验组中 性粒细胞在第45天呈现出显著差异，嗜酸性粒细胞在第36天开始呈 现出极显著差异，这两种粒细胞数量整体呈增加趋势嗜酸性粒细胞 在过敏反响中具有调节作用，该细胞会释放有毒的颗粒蛋白和脂质介 质，引起组织损伤和功能障碍，加剧炎症反响，但也能吞噬抗原抗体复 合物［20］。

这3种血项指标的变化也进一步说明了实验组BALB/c小 鼠对AK产生过敏反响表2 BALB/c小鼠血项指标变化Table 2 Changes in blood index of BALB/c mice 2. 3血清中tlgE、slgE的含量变化2. 3. 1血清中tlgE的含量I型过敏机制由IgE介导，如图4所示,随着免疫时间的增加，实验组小鼠体内tlgE水平也不断升高，对照组基本维持在11 ug/mL 左右与对照组相比，第28天实验组的tlgE含量开始明显增加，之后 呈上。