04 实验四 植物DNA的提取及纯度浓度鉴定.ppt

植物植物DNADNA的提取与鉴定的提取与鉴定 实验四实验四 实验原理实验原理n n真核生物真核生物DNADNA与蛋白质结合，以核蛋白的与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在于细胞核内形式存在于细胞核内n n在提取在提取DNADNA时，通过研磨破坏细胞壁和细时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，释放出核蛋白胞膜，释放出核蛋白 实验原理实验原理n n在在浓浓氯化钠溶液（氯化钠溶液（1～～2 mol／／L）中，）中，DNA核蛋白的溶解度很大，核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋核蛋白的溶解度很小白的溶解度很小n n在在稀稀氯化钠溶液（氯化钠溶液（0.14 mol／／L）中，）中，DNA核蛋白的溶解度很小，核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋核蛋白的溶解度很大白的溶解度很大n n利用不同浓度氯化钠溶液将利用不同浓度氯化钠溶液将DNA核蛋白核蛋白或或RNA核蛋白核蛋白从样品中分别抽提出来从样品中分别抽提出来①①①①在核蛋白溶液加入在核蛋白溶液加入在核蛋白溶液加入在核蛋白溶液加入氯仿－异戊醇氯仿－异戊醇氯仿－异戊醇氯仿－异戊醇，振荡，使蛋，振荡，使蛋，振荡，使蛋，振荡，使蛋白质乳化变性，再离心除去变性蛋白质。

白质乳化变性，再离心除去变性蛋白质白质乳化变性，再离心除去变性蛋白质白质乳化变性，再离心除去变性蛋白质②②②②用用用用十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS））））等去污剂使蛋白质等去污剂使蛋白质等去污剂使蛋白质等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从材料中提取出变性，与核酸分离，从材料中提取出变性，与核酸分离，从材料中提取出变性，与核酸分离，从材料中提取出DNADNA③③③③用用用用苯酚苯酚苯酚苯酚处理，然后离心分层，蛋白变性后则停处理，然后离心分层，蛋白变性后则停处理，然后离心分层，蛋白变性后则停处理，然后离心分层，蛋白变性后则停留在酚层内留在酚层内留在酚层内留在酚层内去除蛋白质的方法去除蛋白质的方法① ① 化学因素化学因素 核酸在核酸在pH4.0pH4.0～～11.011.0稳定，稳定， 否则就变性降解否则就变性降解② ② 物理因素物理因素 DNADNA是长链线状分子，强机是长链线状分子，强机械作用会使械作用会使DNADNA分子断裂分子断裂③ ③ 酶的作用酶的作用 DNADNA酶会降解酶会降解DNADNA分子破坏破坏DNADNA完整结构的因素完整结构的因素 紫外光吸收法鉴定紫外光吸收法鉴定DNADNA纯度和浓度纯度和浓度n n核酸的紫外吸收峰核酸的紫外吸收峰260nm,260nm,蛋白质蛋白质280nm280nmn nDNADNA的的A A260260/A/A280280约约1.81.8，，RNARNA的约的约2.02.0n n1ug/mL1ug/mL的的DNADNA溶液溶液, ,吸光度吸光度A A260260=0.020=0.020 1ug/mL 1ug/mL的的RNARNA溶液，溶液，A A260260=0.022-0.024=0.022-0.024 1.0 1.0个个A A260260相当于相当于50ug/mL50ug/mL的的DNA,40ug/mLDNA,40ug/mL的的RNARNA。

 实验步骤l10mL CTAB分离缓冲液加入分离缓冲液加入50mL 离心管中，离心管中，在在65℃水浴中预热水浴中预热l取剪碎的植物叶片适量，置于预冷的研钵中，取剪碎的植物叶片适量，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎倒入液氮，尽快将叶片研碎l将约将约1g叶片粉末加入预热的叶片粉末加入预热的CTAB分离缓冲分离缓冲液中，轻轻转动混匀，液中，轻轻转动混匀，65℃保温保温30分钟l加加10mL氯仿氯仿-异戊醇（异戊醇（24：：1），轻轻混匀轻轻混匀l室温，室温，4000 rpm离心离心10分钟l用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的净的50mL离心管中，加入等体积的异丙醇，离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来轻轻混匀，使核酸沉淀下来l用玻璃棒将丝状用玻璃棒将丝状DNA搅起，转移至搅起，转移至10mL 70％乙醇中，浸泡洗涤％乙醇中，浸泡洗涤10分钟分钟l用玻璃棒取出用玻璃棒取出DNA沉淀，室温下干燥沉淀，室温下干燥l将将DNA沉淀溶于沉淀溶于0.5 mL TE缓冲液中缓冲液中DNA纯度和浓度鉴定纯度和浓度鉴定l取取100uL DNA溶液（剩余的溶液（剩余的DNA溶液放在溶液放在-20℃保存），用保存），用TE缓冲液稀释缓冲液稀释20，，50和和100倍，测定倍，测定A260和和A280l根据根据A260/A280判断判断DNA纯度纯度l计算提取的计算提取的DNA总量总量试试 剂剂CTABCTAB分离缓冲液分离缓冲液l2% CTAB 2% CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）（十六烷基三甲基溴化铵）l1.4 mol/L 1.4 mol/L NaClNaCl l20 20 mmolmmol/L EDTA /L EDTA l100 100 mmolmmol/L Tris-HCL(pH8.0) /L Tris-HCL(pH8.0) l0.2% 0.2% 巯基乙醇巯基乙醇 CTABn nCTABCTAB（十六烷基三甲基溴化铵）（十六烷基三甲基溴化铵） 阳离子去污剂阳离子去污剂, ,它不仅能使蛋白质变性，还它不仅能使蛋白质变性，还能与核酸形成特异的能与核酸形成特异的核酸－核酸－CTABCTAB复合物。

复合物n n核酸－核酸－CTABCTAB复合物可溶于复合物可溶于≥≥0.7mol/L 0.7mol/L NaClNaCl的高盐缓冲液的高盐缓冲液l异丙醇异丙醇l氯仿氯仿- -异戊醇（异戊醇（2424：：1 1））l液氮液氮l70%70%乙醇乙醇TE TE 缓冲液缓冲液l10mmol/L Tris-HCL （pH7.4）l1mmol/L EDTA思考题l本实验中本实验中CTAB、、EDTA、巯基乙醇的作、巯基乙醇的作用是什么？用是什么？l吸取样品、抽提应注意什么？为什么？吸取样品、抽提应注意什么？为什么？l提取提取DNA时除去蛋白质的方法有哪些？时除去蛋白质的方法有哪些？。