小鼠在免疫抗原后机体产生的特异性免疫应答研究.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑小鼠在免疫抗原后机体产生的特异性免疫应答研究 测验目的：验证小鼠在采纳抗原之后机体产生了特异性免疫回响，并查看小鼠各项生理指标以及免疫器官的回响状况，再查看T细胞和B细胞在此应答的回响状况 测验假设：小鼠免疫灭活疫苗之后，机体会逐步产生特异性免疫应答，一方面T细胞在采纳抗原刺激之后，经过阳性和阴性选择，T细胞从CD4，CD8双阳性选择为单阳性T细胞，并逐步转移，最终到达淋巴结等组织产生效应；另一方面，B细胞也会发育分化为浆细胞和记忆细胞，相应的浆细胞产生抗体以应对抗原由于小鼠在采纳抗原之后，免疫细胞在胸腺和脾脏内的数量和种类将发生变化，另外小鼠血清中也会产生相应的抗体 因此假设，在排出其他偶然因素引起的误差的处境下，有以下结果： 1. 免疫后的小鼠胸腺大小比对照组更小，脾脏大小比对照组更大；另外免疫后小鼠的淋巴结比对照组更大 2. 免疫后的小鼠胸腺免疫细胞数量小于对照组，脾脏免疫细胞数量大于对照组 3. 免疫后小鼠胸腺中的单阳性淋巴细胞比对照组单阳性淋巴细胞更多，双阳性淋巴细胞比对照组更少；免疫后小鼠的脾脏中单阳性淋巴细胞数量多于对照组单阳性淋巴细胞数量。

4. 免疫后小鼠血清里面的抗体检测呈阳性，对照组小鼠血清抗体检测呈阴性 预期结果： 预计结果与假设一致，即： 1. 免疫后的小鼠胸腺大小比对照组更小，脾脏大小比对照组更大；另外免疫后小鼠的淋巴结比对照组更大 2. 免疫后的小鼠胸腺免疫细胞数量小于对照组，脾脏免疫细胞数量大于对照组 3. 免疫后小鼠胸腺中的单阳性淋巴细胞比对照组单阳性淋巴细胞更多，双阳性淋巴细胞比对照组更少；免疫后小鼠的脾脏中单阳性淋巴细胞数量多于对照组单阳性淋巴细胞数量 4. 免疫后小鼠血清里面的抗体检测呈阳性，对照组小鼠血清抗体检测呈阴性 测验方法： 一、小鼠免疫后与对照组的中枢和外周免疫器官的查看 测验原理： 测验采取DH5α灭活菌液为抗原，对小鼠举行注射，小鼠在采纳抗原之后，机体会对其产生免疫应答，然而抗原在体内具有确定的半衰期，重复注射可以提高机体的免疫应答强度当小鼠产生特异性免疫应答之后，机体的中枢和外周免疫器官大小会发生变化，即说明小鼠产生的免疫应答程度 测验材料： 1. BALB/c小鼠：6-10周龄，雄鼠，清洁级，上海斯莱克测验动物有限公司 2. DH5α灭活菌液（2×109个/ml）：制备方法：将DH5α扩增至饱和，取出 3500rpm离心15min，弃上清，用生理盐水重悬计数，121℃，20min灭活，计数并稀释。

3次接种，每次500ul） 3. 工具：1ml注射器（针头），酒精棉球，眼科剪，眼科镊，眼科弯镊，废物 筒，解剖板，离心管（离心管架），小鼠尸体袋 4. 试剂：生理盐水（3次接种，每次500ul） 测验方法： ①第一次抗原免疫小鼠 1. 做好打定工作，注射器内装入1ml DH5α灭活菌液和生理盐水 2. 腹腔注射： 提防抓起小鼠，使小鼠腹部朝上，用酒精棉球擦一擦，向小鼠的中线略 左的位置，先挑其表皮，再斜向下插入0.5-1cm的距离，注射后拔出，用剪刀剪去耳朵做好标记 3. 鼠笼做好标记，等待一周后，再其次次免疫小鼠 ②其次次免疫小鼠 大约一周后，根据做好的标记，用一致的方法举行免疫，再放回鼠笼，等待 一周 ③第三次免疫小鼠 大约一周后，根据做好的标记，用一致的方法举行免疫，再放回鼠笼，等待 一周 ④取小鼠血清，脾脏，胸腺及腹股沟淋巴结 a. 小鼠的眼部取血 1. 离心管，离心管架打定，套上保鲜膜，并做好标记 2. 对应标记的取血：提防抓起小鼠，暴露其眼球，提防剪去眼球以及相应血 管，并轻轻抚摩小鼠胸部，尽量收集血液。

3. 等小鼠不再流血后，脱臼法处死小鼠，血液静置一小时，并编号 b. 脾脏，胸腺及腹股沟淋巴结的摘取 1. 取处死的小鼠，腹部朝上，使腹腔伸展，并固定四肢 2. 解剖剪去上皮，提防将上皮撕开，在腹股沟约三叉血管交错处探索类似球 形实心组织，即为淋巴结 3. 提防剪开腹部，在小鼠右侧肠道位置找到脾脏并取出 4. 提防剪开胸骨，在心脏上部找到两瓣白色的器官，即为胸腺 c. 血清分开 1. 静置的血清，离心5min，3000rpm 2. 提防取上清液，编号，若为淡黄色，即可收集保存，否那么重复第一步 3. 冷藏血清，为后续测验做打定 数据获取及处理： 获得免疫组和对照组的免疫器官之后，将其置于一张纸上比较拍照，并通过照片查看可得到相应结论 二、小鼠免疫后淋巴器官中淋巴细胞十足数的变化 测验原理： 利用200目钢丝筛网，研磨胸腺和脾脏并过滤掉结缔组织，即可获得淋巴细胞和红细胞的混合物，通过红细胞裂解液的作用使红细胞裂解，即可获得纯的淋巴细胞，通过血细胞计数板的计数，即可回响各个淋巴器官的淋巴细胞的数量变化。

测验材料： 1. BALB/c小鼠：6-10周龄，雄鼠，清洁级，上海斯莱克测验动物有限公司 2. DH5α灭活菌液（2×109个/ml）：制备方法：将DH5α扩增至饱和，取出3500rpm 离心15min，弃上清，用生理盐水重悬计数，121℃，20min灭活，计数并稀释1次接种， 500ul） 3. 工具：1ml注射器（针头），酒精棉球，眼科剪，眼科镊，眼科弯镊，废物筒， 解剖板，离心管（离心管架），小鼠尸体袋，细胞计数板（载玻片），显微镜，擦镜纸，天平，离心机，200目筛网 4. 试剂：生理盐水（1次接种，500ul）,75%酒精，1×PBS，RBC裂解液，3%冰 醋酸 测验步骤： ①小鼠免疫：本测验需要免疫一次的小鼠，测验方法与三次免疫小鼠的第一次相 同 ②眼球取血：方法同前面的取血方法一致 ③小鼠的脾脏和胸腺的淋巴细胞分开 1. 摘取小鼠的脾脏和胸腺，置于两份PBS溶液中，做好标记方法与脾脏 和胸腺的查看的摘取方法一致） 2. 用200目筛网研磨过滤，并转移到15ml离心管中，编号 3. 2500rpm，10min离心（天平配平）。

4. 弃上清，对脾脏细胞参与1mlRBC裂解液重悬裂解，5min；对胸腺细胞加 入1mlPBS，待用 5. 脾脏溶液加1×PBS终止裂解，配平，4℃离心2000rpm，10min 6. 向脾脏细胞参与1mlPBS重悬，将脾脏细胞和胸腺细胞悬液混匀，各取10ul， 编号 7. 参与等体积的冰醋酸，PBS稀释，方法如下： 免疫后：脾脏200倍，胸腺10倍 对照组：脾脏100倍，胸腺100倍 8. 细胞计数 a. 取计数板和盖玻片，用酒精洗净后用擦镜纸擦干 b. 盖玻片置于计数室上部，用枪吸取10ul待测细胞溶液，加至载玻片边缘， 待其自行渗入 c. 显微镜查看计数（10×10，100倍） 结果结果=四个大格子总数×0.25×104×稀释倍数 数据获取和处理：通过显微镜下查看计数板的四个大方格，做到数上不数下，数 左不数右的原那么，计数全体细胞后，结果细胞的个数=四个大格子总数×0.25×104×稀释倍数，并记录下来 三、小鼠免疫后T细胞的发育分化的处境查看 测验原理： ①免疫标记技术：指用荧光素，放射性同位素，酶，铁蛋白等作为追踪物，标记抗体举行抗原抗体回响。

本次测验使用荧光素标记后，利用流式细胞仪，对相应的细胞举行检测 ②流式细胞术：是一种在液流状态下，通过检测大批量的单个细胞的生物学性质，并将其分类的一种技术一般通过快速测定荧光，电阻，光散射和光吸收等方法来测定细胞的各种参数 测量样品要求： 单细胞悬液，细胞大小0.2-50um，样品至少有20000个细胞，浓度105?107个/ml 流式细胞仪通常以激光作为发光源经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收光散射信号在前向小角度举行检测，这种信号根本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的采纳方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分开，形成多个不同波长的荧光信号这些荧光信号的强度代表了细胞外观物质的浓度，经过光电倍增管将相应的信号转化为电信号，电信号转化为数字信号，通过计算器的处理，结果将分析结果显示在计算机上 抗体选择：由于需要将CD4，CD8阳性分开，因此标记CD4，CD8分子，于是采用： FITC-CD4，PerCP-CY5.5-CD8两种荧光标记细胞。

同型对照：用与检测特异性无关的同型同亚型同荧光抗体染色，作为同型对照 测验材料： Ep管（Ep管架），离心机，移液器（枪头），吸水纸，流式管，废液缸 1×PBS，大鼠血清（iso），抗体FITC-CD4，PerCP-CY5.5-CD8以及同型对照抗体 — 8 —。