优秀本科课件《生物化学与分子生物学第九版》：第十二章DNA合成.pdf

第十二章 DNA合成 第一节 DNA复制的基本规律 第二节 DNA复制的酶学和拓扑学 第三节 原核生物DNA复制过程 第四节 真核生物DNA复制过程 第五节 逆转录 重点难点 熟悉 了解 掌握 掌握DNA复制体系的组成、半保留复制的特点及其意义；掌 握DNA复制的基本规律， DNA聚合酶的类型及功能特点 DNA复制的过程，原核DNA复制与真核DNA复制的主要区 别；真核生物DNA端粒及端粒酶 非染色体DNA复制的其他形式；了解逆转录的发现发展了中 心法则 DNA复制的基本规律 The basic law of DNA replication 第一节 DNA复制的主要特征: 半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication) 在复制时，亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板， 依据碱基配对规律，合成序列互补的子链DNA双链 一、DNA以半保留方式进行复制 半保留复制的概念: 子链继承母链遗传信息的几种可能方式: 全保留式全保留式半保留式半保留式混合式混合式 密度梯度实验: 含含15N-DNA的细菌的细菌 培养于普培养于普 通培养液通培养液 第一代第一代 继续培养于继续培养于 普通培养液普通培养液 第二代第二代 依据半保留复制的方式，子代DNA中保留了亲代的全部遗 传信息，亲代与子代DNA之间碱基序列的高度一致 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的 半保留复制的意义: T C C A T G A C G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G + 母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成 的复制叉的复制叉 子代子代DNA 二、DNA复制从起始点双向进行 原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点 （origin）。

复制从起点开始，向两个方向进行解链，进 行的是单点起始双向复制 复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象 A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter) ori ter A B C 真核生物每个染色体又有多个起点，呈多起点双向复制特 征每个起点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成 时，复制叉相遇并汇合连接从一个DNA复制起点起始 的DNA复制区域称为复制子（replicon）复制子是含 有一个复制起点的独立完成复制的功能单位 5 3 oriorioriori 5 3 5 3 oriorioriori 5 3 5 5 3 3 5 5 3 复制复制 3 三、DNA复制以半不连续方式进行 3 5 3 5 解链方向解链方向 领头链领头链 (leading strand) 后随链后随链 (lagging strand) 沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的，这股链称为前导链（leading strand） 另一股链因为复制方向与解链方向相反，不能连续延长，只能随着模板链的解开，逐段地从 53生成引物并复制子链。

模板被打开一段，起始合成一段子链；再打开一段，再起始合 成另一段子链，这一不连续复制的链称为后随链（lagging strand） 沿着后随链的模板链合成的新DNA片段被命名为冈崎片段（Okazaki fragment） 四、DNA复制具有高保真性 “半保留复制”确保亲代和子代DNA分子之间信息传递 的绝对保真性 高保真度DNA聚合酶利用严格的碱基配对原则是保证复 制保真性的机制之一；体内复制叉的复杂结构提高了复制 的准确性；DNA聚合酶的核酸外切酶活性和校读功能以 及复制后修复系统对错配加以纠正 DNA复制的酶学和拓扑学 Enzymology and topology of DNA replication 第二节 参与DNA复制的物质: 底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol 模板(template): 解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子 (dNMP)n+ dNTP (dNMP)n+1+ PPi 一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol 活性： 1. 53的聚合活性 2. 核酸外切酶活性 核酸外切酶活性: 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | | 3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 ? 35外切酶活性: 能辨认错配的碱基对，并将其水解 53外切酶活性: 能切除突变的 DNA片段 （一）原核生物有3种DNA聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 分子量（kD）109120250 组成单肽链？多亚基不对称二聚体 分子数/细胞400？20 53核酸外切酶活性有无无 基因突变后的致死性可能不可能可能 原核生物的DNA聚合酶 个核心酶 1个 -复合物（ 、 、 、 、 、 6种亚 基） 1对 -亚基（可滑动 的DNA夹子） 全酶结构包括： DNA聚合酶全酶结构: 亚基（130 000）主要功能是合成DNA 亚基具有35 外切酶活性（复制保真性 所必需） 亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用 核心酶由 、 和 亚基组成： 两侧的亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模 板滑动的作用 2个 -亚基分别和1个核心酶相互作用， 其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子 的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合 成前导链和后随链 功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶 活性的作用 -复合物由6种亚基组成： 、 、 、 、 、 对复制中的错误进行校读， 对复制和修复中出现的空 隙进行填补 功能： DNA-pol （109kD）: 323个氨基酸个氨基酸 小片段小片段 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸 DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 N 端端 C 端端 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行 分子生物学研究中常用的工具酶分子生物学研究中常用的工具酶 DNA-pol （120kD）: DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模 板上，它也能催化核苷酸聚合。

因此认为，它参与DNA损伤的应 急状态修复 （一）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种 DNA-pol 起始引发，有引物酶活性 DNA-pol 参与低保真度的复制 DNA-pol 粒体DNA复制中起催化作用 DNA-pol 合成后随链 DNA-pol 合成前导链 E.Coli真核细胞功能 填补复制中的DNA空隙，DNA修复和重组 复制中的校对，DNA修复 DNA修复 线粒体DNA合成 前导链合成 DnaG 引物酶 后随链合成 真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较 DNA-pol 分子量（kD）16.54.014.012.525.5 53聚合活性中？高高高 35核酸外切 酶活性 --+++ 功能 起始引发， 引物酶活性 低保真度的复 制 线粒体DNA 复制 合成后随链合成前导链 真核生物的DNA聚合酶 二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能 DNA复制的保真性至少要依赖三种机制: 遵守严格的碱基配对规律 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能 复制出错时有即时校对功能 （一）复制的保真性依赖正确的碱基选择 利用“错配”实验发现，DNA pol 对核苷酸的参入 （incorporation）具有选择功能 DNA pol 对不同构型糖苷键表现不同亲和力，因此实 现其选择功能 （二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中 辨认切除错配碱基并加以校正 核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的 酶，外切酶是有方向性的 A：DNA-pol的外切酶活性切除 错配碱基；并用其聚合活性掺 入正确配对的底物 B：碱基配对正确， DNA-pol不 表现活性 DNA pol 的校 读功能 三、复制中DNA 分子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把 DNA解成单链，它才能起模板作用。

蛋白质（基因）通用名功能 DnaA（dnaA）辨认复制起始点 DnaB（dnaB）解旋酶解开DNA双链 DnaC（dnaC）运送和协同DnaB DnaG（dnaG）引发酶催化RNA引物生成 SSB单链结合蛋白/DNA结合蛋白稳定已解开的单链DNA 拓扑异构酶拓扑异构酶又称促旋酶解开超螺旋 原核生物复制中参与DNA解链的相关蛋白质 （一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态 解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为 两条单链 引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复 制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整 解链过程中正超螺旋的形成 复制过程正超螺旋的形成： AB C DNA只固定一端DNA两端固定 解开10个碱基对 （一个螺旋） DNA将会 旋转一圈 DNA形成 一个超螺旋 解开10个碱基对 （一个螺旋） 蛋白分子 DNA 负超螺旋 开口易化 正超螺旋 开口受阻 拓扑异构酶作用特点: 既能水解 、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶分类及作用机制： 拓扑异构酶：切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当 时候封闭切口，DNA变为松弛状态。

反应不需ATP 拓扑异构酶：切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态 拓扑酶的作用方式： 四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口 连接DNA链3 -OH末端和相邻DNA链5 - P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段 相邻的DNA链连接成一条完整的链 DNA连接酶(DNA ligase)作用方式： DNA连接酶的作用： 功能: DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用 也是基因工程的重要工具酶之一 DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较 提供核糖3 -OH提供5 -P结果 DNA聚合酶引物或延长中的 新链 游离dNTP去PPi(dNTP)n+1 连接酶复制中不连续的两条单链不连续连续链 拓扑酶切断、整理后的两链改变拓扑状态 原核生物DNA复制过程 DNA replication in prokaryotes 第三节 起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中 ，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体 ，形成复制。